鸭源葡萄球菌分离鉴定、毒力基因检测及与致病性相关性研究

摘要

本试验采用细菌分离技术、微生物学技术、PCR技术从2011-2013年广西壮族自治区以及湖北省部分鸭养殖场送检的组织中进行鸭源葡萄球菌分离鉴定，并研究葡萄球菌毒力基因与对小鼠、家兔、鸭致病性之间的相关性。
　　从鸭的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、脑、关节、肠组织中分离到细菌，纯化培养后的细菌经生长特性、溶血特性、血浆凝固酶特性、生化培养特性、16SrRNAPCR方法进行鉴定，共分离到39株葡萄球菌，其中猪葡萄球菌、表皮葡萄球菌各1株，溶血葡萄球菌2株，金黄色葡萄球菌、科氏葡萄球菌、阿涅蒂斯葡萄球菌各3株，伪中间型葡萄球菌8株，松鼠葡萄球菌18株。
　　本研究根据文献和GenBank公布的基因序列合成葡萄球菌的hla、hlb、hlg、hid、coa、pvl、clfA7种毒力因子基因引物，通过PCR检测表明，39株鸭源葡萄球菌中23.1％(9/39)携带有hla基因，25.6％(10/39)携带有hlb基因，10.3％(4/39)携带有hlg基因，12.8％(5/39)携带有hid基因，30.8％(12/39)携带有coa基因，25.6％(10/39)携带有pvl基因，7.7％(3/39)携带有clfA基因。其中猪葡萄球菌G2株表现为coa+，表皮葡萄球菌G4株表现为hid+，松鼠葡萄球菌G74株、阿涅蒂斯葡萄球菌G84株表现为hia+，溶血葡萄球菌仅一株表现为hid+，伪中间型葡萄球菌G6株、G8株、G10株、G29株、G30株、G39株、G87株表现为hla+/hlb+coa+/pvl+，伪中间型葡萄球菌G9株表现为hla+/hlb-/coa+/pvl+。金黄色葡萄球菌G7株、G27株表现为hia+/hlb+/hlg+/hld+/coa+/pvl+/clfA+，金黄色葡萄球菌G54株表现为hia+/hlb+/hlg+/hld+/coa+/pvl-/clfA+。科氏葡萄球菌无毒力因子基因检测出。可见鸭源葡萄球菌各菌种间毒力因子基因分布存在差异，金黄色葡萄球菌毒力因子分布与国内报道的差异较小。
　　39株鸭源葡萄球菌感染小鼠临床症状和病理变化:伪中间型葡萄球菌G6株、G8株、G10株、G30株，金黄色葡萄球菌G7株、G27株、G54株可引起小鼠腹部接种部位的皮肤出现溃烂。猪葡萄球菌G2株，伪中间型葡萄球菌G29株、G30株、G39株、G87株，金黄色葡萄球菌G7株，松鼠葡萄球菌G74株，阿涅蒂斯葡萄球菌G84株可引起小鼠死亡。
　　猪葡萄球菌G2株、表皮葡萄球菌G4株、松鼠葡萄球菌G5株、伪中间型葡萄球菌G6株、G9株，金黄色葡萄球菌G7株、溶血葡萄球菌G13株、科氏葡萄球菌G24株感染家兔和鸭病理变化:猪葡萄球菌G2株、伪中间型葡萄球菌G6株、金黄色葡萄球菌G7株可引起家兔肾黄豆大小的斑点，鸭胸腺、肝脏出血，心包腔有多量淡黄色透明或半透明液体增多，且伪中间型葡萄球菌G6株、金黄色葡萄球菌G7株引起鸭腹腔内有纤维素性渗出物，仅金黄色葡萄球菌G7株引起鸭死亡。金黄色葡萄球菌G54株感染家兔引起腹膜炎。
　　综上所述，本论文主要完成了鸭源葡萄球菌的分离鉴定，毒力基因的扩增以及菌株对小鼠、家兔、鸭致病性试验的建立，为葡萄球菌毒力基因与致病性的相关性研究打下工作基础。

目录

声明

摘要

缩略词表

前言

1 葡萄球菌病原学及流行病学

2 葡萄球菌毒力因子

2．1 溶血素α(hla)

2．2 溶血素β(hlb)

2．3 溶血素γ(hlg)

2．4 溶血素δ(hld)

2．5 血浆凝固酶(coa)

2．6 杀白细胞素(pvl)

2．7 聚集因子A(clfA)

2．8 其他毒力因子

3 葡萄球菌病理变化及致病机制

本研究的目的与意义

材料与方法

1 材料

1．1 病料来源

1．2 主要试剂

1．3 实验动物及处理

1．4 主要仪器设备

2 方法

2．1 葡萄球菌的分离

2．2 葡萄球菌的微生物学鉴定

2．3 葡萄球菌16SrRNA基因鉴定

2．4 菌种保存

2．5 葡萄球菌毒力基因扩增

2．6 葡萄球菌感染小鼠致病性试验

2．7 葡萄球菌感染家兔致病性试验

2．8 葡萄球菌感染鸭致病性试验

结果

1 葡萄球菌分离结果

2 葡萄球菌微生物学鉴定

2．1 葡萄球菌形态特征鉴定结果

2．2 葡萄球菌生长特性鉴定结果

2．3 葡萄球菌溶血特性鉴定结果

2．4 葡萄球菌血浆凝固酶试验鉴定结果

2．5 葡萄球菌生化培养特性结果

3 葡萄球菌的16SrRNA PCR方法鉴定

3．1 葡萄球菌16SrRNA基因扩增结果

3．2 葡萄球菌16SrRNA基因扩增序列BLAST比对结果

4 葡萄球菌归类

5 葡萄球菌毒力基因扩增结果

5．1 葡萄球菌hla基因扩增结果

5．2 葡萄球菌hlb基因扩增结果

5．3 葡萄球菌hlg基因扩增结果

5．4 葡萄球菌hld基因扩增结果

5．5 葡萄球菌coa基因扩增结果

5．6 葡萄球菌pvl基因扩增结果

5．7 葡萄球菌clfA基因扩增结果

6 葡萄球菌毒力基因分布

7 葡萄球菌感染小鼠试验

7．1 葡萄球菌感染小鼠临床症状观察结果

7．2 葡萄球菌感染小鼠剖检病理变化结果

7．3 葡萄球菌感染小鼠脏器细菌分离结果

8 葡萄球菌感染家兔试验

8．1 葡萄球菌感染兔临床症状观察结果

8．2 葡萄球菌感染家兔剖检病理变化结果

8．3 葡萄球菌感染家兔脏器细菌分离结果

9 葡萄球菌感染鸭试验

9．1 葡萄球菌感染鸭临床症状观察结果

9．2 葡萄球菌感染鸭剖检病理变化结果

9．3 葡萄球菌感染鸭脏器细菌分离结果

讨论

1 鸭养殖场葡萄球菌的分离

2 鸭源葡萄球菌毒力因子分布特征

3 鸭源葡萄球菌毒力基因与致病性的关系

结论

参考文献

致谢