西瓜非生物胁迫响应R2R3MYB转录因子基因鉴定

摘要

MYB类转录因子家族是植物中最大的转录因子家族之一，参与了细胞分化、激素和环境因子应答等生物过程，并对次生代谢、花色素形成过程以及叶片等器官形态建成具有重要的调节作用。西瓜是重要的蔬菜作物，西瓜基因组测序的完成为揭示MYB家族转录因子在西瓜生长发育过程中的调控作用奠定了坚实的基础。本文以西瓜基因组测序材料97103(C.lanatus(Thunb.)Matsum.&Nakaivar.lanatus）为试验材料，通过生物信息学的方法，在全基因组水平上对西瓜R2R3MYB转录因子基因家族进行了鉴定和分类;分析了其基因结构、蛋白质结构域特征、系统进化关系、染色体定位;利用RT-PCR技术研究R2R3MYB转录因子家族在非生物胁迫下的基因表达，包括低温、干旱、盐和ABA;克隆了MYB转录因子基因ClMYB55，与植物表达载体PBI121构建超量表达载体。同时以本实验室保存的野生西瓜W001为试验材料，对西瓜再生体系和遗传转化体系进行了优化。主要实验结果如下:
　　1、利用隐马尔科夫模型、西瓜基因组数据库，在全基因组上鉴定出西瓜MYB家族基因234个，其中R2R3MYB类转录因子基因79个。西瓜79个R2R3MYB基因不均匀的分布在西瓜11条染色体上，其中第2、3、6、10条染色体上分布较多，多在首尾两端，中间分布较少;西瓜MYB基因含有的外显子数量在1-4之间，76％的基因含有3个外显子。而在不同长度的外显子中，有2种外显子在结构和分布上高度保守，大小分别为130bp和133bp，分布在基因两端;多序列联配比对结果显示这些转录因子都含有完整的R2、R3结构域，其中R3的第一个色氨酸大部分被苯丙氨酸取代。
　　2、用RT-PCR技术分析了60个西瓜R2R3MYB转录因子家族基因在低温、干旱、ABA和盐胁迫下根和叶中的表达，共有42个基因检测到表达，其中5个基因不受胁迫诱导而稳定表达，37个基因参与胁迫响应。2个基因在叶中同时参与低温、干旱、ABA和盐4种非生物胁迫响应，21个基因同时参与2-3种非生物胁迫响应，14个基因特异性只参与1种非生物胁迫响应。叶和根中响应低温胁迫的基因有16个，响应干旱胁迫的基因有18个，响应ABA胁迫的基因有20个，响应盐胁迫的基因有15个。
　　3、以5d左右苗龄的野生西瓜W001的无菌苗子叶为外植体，筛选了芽诱导最适培养基，并对伸长培养基和生根培养基进行了优化。结果表明，当BA浓度为1mg/L时，外植体的诱导率最高，平均每个外植体的丛生芽数达6个;再生芽在MS+KT(0.1、0.2、0.3mg/L)三种伸长培养基中都能正常伸长;最佳生根培养基为MS+NAA0.05mg/L，生根率达62％。初步建立适用于野生西瓜遗传转化的子叶再生系统。
　　4、根据ClMYB55转录因子基因序列，设计特异引物，以西瓜97103幼苗为材料，克隆了ClMYB55转录因子基因的全长cDNA和CDS序列。并将ClMYB55基因的CDS序列和植物表达载体PBI121连接，构建了35S∷ClMYB55超量表达载体，命名为PBI55。
　　5、利用正交法，以野生西瓜子叶外植体为试验材料，通过检测GUS瞬时表达率，对农杆菌介导的西瓜遗传转化体系进行了优化。结果表明，野生西瓜遗传转化优化体系包括:子叶外植体预培养时间为2d、菌液浓度(OD600)为1.0、侵染时间为15min、共培养时间为4d。

目录

声明

摘要

缩略词表

1 前言

1．1 课题的提出

1．2 植物MYB转录因子

1．2．1 MYB转录因子的结构和分类

1．2．2 MYB转录因子的起源与进化

1．2．3 MYB转录因子的功能

1．2．4 西瓜中MYB转录因子研究进展

1．3 西瓜组织培养与遗传转化

1．3．1 西瓜组织培养

1．3．2 西瓜遗传转化

1．4 本研究的目的与意义

2 材料与方法

2．1 试验材料

2．1．1 植物材料

2．1．2 菌种、质粒、培养基以及各种生化试剂

2．2 西瓜R2R3MYB转录因子家族的生物信息学预测与分析

2．2．1 西瓜R2R3MYB转录因子家族成员搜索

2．2．2 R2R3MYB基因结构分析

2．2．3 多序列比对和构建系统发育树

2．3 西瓜R2R3MYB转录因子基因表达分析

2．3．1 非生物胁迫及取样时间

2．3．2 MYB转录因子基因的引物

2．3．3 RT-PCR

2．4 MYB转录因子基因的克隆

2．4．1 转录因子CIMYB55基因全长cDNA和CDS序列克隆

2．4．2 纯化回收PCR产物连接T载体并转化、测序

2．5 西瓜遗传转化体系的建立

2．5．1 西瓜组培再生体系的优化

2．5．2 超量表达载体的构建

2．5．3 西瓜的遗传转化优化

2．6 数据分析

3 结果与分析

3．1 西瓜R2R3MYB转录因子家族的生物信息学预测与分析

3．1．1 西瓜R2R3MYB转录因子家族成员预测

3．1．2 西瓜R2R3MYB转录因子基因染色体定位

3．1．3 西瓜R2R3MYB转录因子蛋白的保守序列分析

3．1．4 R2R3MYB基因结构分析

3．1．5 西瓜R2R3MYB转录因子蛋白的系统进化分析

3．2 西瓜R2R3MYB转录因子基因表达分析

3．2．1 低温胁迫响应分析

3．2．2 干旱胁迫响应分析

3．2．3 ABA胁迫响应分析

3．2．4 盐胁迫响应分析

3．2．5 叶和根中响应胁迫基因的表达分析

3．2．6 四种胁迫下基因表达比较

3．3 MYB转录因子基因的克隆

3．3．1 转录因子C1MYB55基因全长cDNA和CDS序列的获得

3．3．2 C1MYB55基因全长cDNA和CDS序列的测定与分析

3．4 西瓜遗传转化体系的建立

3．4．1 野生西瓜组培再生体系的优化

3．4．2 超量表达载体的构建

3．4．3 野生西瓜的遗传转化优化

4 讨论

4．1 西瓜R2R3MYB转录因子家族基因鉴定

4．2 西瓜非生物胁迫响应R2R3MYB转录因子家族基因

4．3 野生西瓜再生体系与遗传转化

4．3．1 西瓜离体再生体系的建立

4．3．2 野生西瓜的遗传转化优化

5 全文总结

参考文献

附录Ⅰ 西瓜组培再生和遗传转化优化

附录Ⅱ 载体图片

附录Ⅲ 基因表达使用的引物

附录Ⅳ GUS染色方法

致谢