蛋白质的理化性质对山羊β-防御素抗菌活性的影响

摘要

防御素是一种广泛分布的小型阳离子抗菌肽，富含精氨酸，具有广谱、高效的抗菌活性，同时对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌等具有一定的抑菌效果，防御素的抗菌机理与抗生素抑菌机理完全不同，细菌无耐药性产生，因此防御素有望成为替代抗生素的新型抗菌药物。从生物体中提取防御素则量少、成本高、活性较低，因此通过分子改造或全新设计生产，表达高活性防御素的研究具有重要意义。
　　本课题以山羊β-防御素作为模板研究防御素蛋白质的理化性质对其抗菌活性的影响。在不改变原始序列氨基酸保守区域组成的情况下对山羊β-防御素蛋白的氨基酸进行随机替换得到了29477条序列的防御素改造基因库，预测蛋白质的生理生化指标将它们分成5大类，从中筛选出12条设计防御素(DGBD1-12)，其中疏水指数较高的序列:DGBD1-3;不稳定指数较低，接近于原防御素的序列:DGBD4-6;精氨酸含量较高，其正电荷也较高的序列:DGBD7-9;等电点较好，接近于原防御素的序列:DGBD10-12。根据山羊β-防御素1的序列，利用毕赤酵母密码子偏好性设计含有部分互补序列的引物，在引物两端引入EcoRⅠ和NotⅠ两个限制性内酶切位点，通过重叠PCR法和全基因合成得到设计的DGBD基因。将鉴定正确的DGBD基因片段连接到pPICZαA真核表达载体中，经酶切、测序鉴定正确后，用SacⅠ将重组表达质粒pPICZαA/DGBD线性化，电转入到毕赤酵母宿主细胞GS115，用含有Zeocin的培养基筛选，并进行PCR检测。阳性的酵母重组质粒每24h用1％浓度的甲醇诱导，通过BCA法测定72h诱导后的蛋白浓度;利用稀释药敏试验和抑菌圈法测定设计防御素抑菌活性。
　　试验结果发现防御素DGBD1-12对大肠杆菌ATCC25922、大肠杆菌NK5449、空肠弯曲菌（猪源）、沙门氏菌（临床）、乳酸杆菌、藤黄微球菌ATCC9341、粪肠球菌JH2-2、大肠杆菌（鸭源）、粪肠球菌ATCC29212、鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌ATCC29213、金黄色葡萄球菌（临床）十二株细菌都有抑制作用，对所测细菌中革兰阴性菌的抑菌作用较强。其中以DGBD4的抑菌作用最强。在一定范围内，防御素及其改造后的防御素随着疏水性和结构稳定性的增加，抑菌能力增强。这对解释防御素的作用机制、根据防御素多肽的理化性质设计具有应用前景的抗菌药物具有重要的作用。

目录

声明

摘要

英文缩略词表(Abbreviation)

第一章 文献综述

1 防御素及其种类

1．1 α-防御素

1．2 β-防御素

1．3 θ-防御素

1．4 昆虫防御素

1．5 植物防御素

2 防御素的生物学活性

2．1 抗细菌活性

2．2 抗真菌活性

2．3 抗病毒活性

2．4 抗癌作用

2．5 免疫调节作用

2．6 细胞毒作用

2．7 其他生物活性

3 防御素作用机理

4 影响防御素抗菌活性的构效关系

5 研究目的和意义

第二章 山羊β-防御素基因的体外改造

1 引言

2 试验材料

2．1 基因序列

2．2 分析工具

3 试验方法

3．1 防御素替换序列的获得

3．2 改造防御素理化性质的预测

3．3 预测数据的SAS分析及序列的筛选

4 结果与分析

4．1 替换数据库的构建

4．2 替换后防御素的理化性质预测

4．3 SAS分析结果的方差分析

4．4 正态分布分析及序列的选择

5 讨论

第三章 山羊DGBD基因表达载体的构建和鉴定

1 引言

2 试验材料

2．1 质粒、菌株

2．2 主要药品及试剂

2．3 常用试剂的配制

2．4 主要仪器设备

3 试验方法

3．1 DGBD基因的合成

3．2 重组表达质粒的构建

3．3 DGBD在毕赤酵母中的表达

3．4 蛋白浓度测定

3．5 抑菌试验

4 结果与分析

4．1 DGBD的PCR扩增和序列分析

4．2 重组表达质粒的鉴定

4．3 重组表达质粒线性化检测

4．4 蛋白浓度检测结果

4．5 抑菌结果检测

5 讨论

第四章 全文结论

1 主要研究结果

2 值得进一步研究的相关问题

关键词索引

参考文献

致谢