乙型脑炎病毒非结构蛋白NS5与宿主蛋白相互作用的研究

摘要

乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)属于黄病毒科黄病毒属，是一种危害严重的人兽共患虫媒性传染病病原，感染人和动物后可以引起乙型脑炎（简称乙脑）。该病是人类中枢神经系统最常见的虫媒病之一，对人类健康造成巨大威胁，同时乙脑也是危害我国养猪业的重大疫病之一。JEV感染引起机体中枢神经系统过度炎症反应是其致病的主要原因，但目前，具体的致病机制尚不太清楚。近年研究表明，JEV蛋白与宿主细胞蛋白的相互作用对病毒入侵、复制、神经毒力、神经炎症反应、天然免疫逃逸及诱导宿主保护性免疫等方面可产生重要影响。JEV非结构蛋白NS5具有甲基转移酶和RNA依赖的RNA聚合酶活性，在病毒基因组的复制以及病毒的致病中发挥重要作用。因此，研究JEV NS5蛋白与宿主蛋白相互作用对于揭示该病毒的复制与致病机理以及抗病毒药物的开发具有重要科学意义。另外，由于JEV致病机制的复杂性，临床中针对该病的有效治疗方法也十分缺乏，因此探索针对乙脑的治疗药物，对该疾病的临床防治具有重要意义。本论文主要围绕JEV NS5蛋白与宿主蛋白相互作用对病毒复制、病毒逃避宿主抗病毒反应的影响，以及药物依那西普对乙脑的治疗效果这几个方面来展开研究，具体内容如下:
　　1.JEV NS5蛋白与HSP70相互作用的研究利用串联亲和纯化（TAP）与质谱分析将结合的方法，在HEK293T细胞中筛选出可能与JEV NS5蛋白相互作用的宿主蛋白，并通过免疫共沉淀进行验证，证明JEVNS5可与HSP70、eEF-1α、Ran这三个蛋白相互作用。通过构建NS5缺失突变体，发现NS5可通过RNA聚合酶（RdRp）结构域与HSP70直接结合。除了NS5以外，HSP70还可与JEV NS3蛋白以及病毒基因组RNA发生免疫共沉淀，并通过免疫荧光发现，HSP70可与NS3、NS5以及病毒复制过程中产生的dsRNA发生共定位。由于NS3、NS5以及病毒基因组是JEV复制复合体的主要组成部分，说明HSP70可台能参与JEV复制复合体的形成。进一步通过RNA干扰实验证明，HSP70可对JEV的复制起正调节作用。对其分子机制的研究发现，抑制HSP70的表达，可导致复制复合体中NS3、NS5蛋白发生K48泛素化而通过蛋白酶体降解，证明HSP70可通过其分子伴侣的功能稳定复制复合体中NS3、NS5的结构，从而帮助病毒复制。本研究首次证明了HSP70在JEV复制中发挥重要作用，为揭示JEV的复制机制提供了新的线索。
　　2.JEV NS5蛋白抑制细胞内入核运输途径的研究细胞质与细胞核之间的分子运输是维持细胞正常生理功能的重要环节，本研究通过荧光报告系统探索JEV对宿主细胞质-核运输的影响。研究发现，JEV NS5蛋白可抑制细胞中经典核定为序列(NLS)介导的蛋白入核运输。通过免疫共沉淀实验发现，NS5蛋白可与核转运蛋白KPNA2、KPNA3、KPNA4相互作用，但并不影响这些核运输蛋白的表达水平。进一步实验证明NS5可抑制由KPNA3、KPNA4介导的NF-κB亚基p50、p65的入核，并抑制NF-κB的转录活性。机制分析发现，JEV NS5可抑制p50、p65与KPNA3、KPNA4的相互作用。由于NF-κB是Ⅰ型干扰素的重要转录因子，因此检测IFN-β水平发现，NS5可抑制poly(I∶C)刺激的IFN-β的分泌，而过表达KPNA2、KPNA3、KPNA4可回复IFN-β的表达，并促进JEV刺激的IFN-β的分泌。另外，KPNA2、KPNA3、KPNA4的过表达还可抑制JEV的复制。说明，JEV NS5可通过靶向KPNA2、KPNA3、KPNA4来抑制宿主细胞的抗病毒反应。本研究揭示了一种JEV逃避宿住抗病毒反应的新策略，为病毒致病机制的研究提供了重要线索。
　　3.依那西普对乙型脑炎的治疗作用研究JEV感染会引起中枢神经系统中炎症因子大量分泌，其中TNF-α具有较强的神经毒性，是JEV致病的关键因子。依那西普作为一种安全的商品化药物对TNF-α通路具有良好的抑制效果。本研究利用小鼠神经元/胶质细胞混合培养体系以及Balb/c小鼠模型，从体外体内实验两方面评估依那西普对乙型脑炎的治疗情况。体外实验结果表明，依那西普可有效降低JEV感染神经元/胶质细胞中炎症因子的分泌以及细胞的凋亡。体内实验结果表明，依那西普可显著缓解JEV感染引起小鼠的神经炎症反应，主要包括:脑部炎症因子分泌的减少、脑组织病理症状的减轻、胶质细胞激活的抑制、神经元凋亡的减少、血脑屏障通透性的降低等。机制分析发现，依那西普可有效抑制caspase3、NF-κB、AP-1等凋亡和炎症相关的信号分子的激活。另外，荧光定量和空斑实验结果表明依那西普治疗明显降低了小鼠脑部JEV病毒的载量。更重要的是，依那西普治疗的小鼠的临床症状明显改善，存活率比未给药组高出50％。上述结果表明依那西普有潜力成为一种用于乙脑治疗的药物，从而为乙脑和其他嗜神经病毒感染的治疗提供了一种新思路。

目录

声明

摘要

缩略语表(Abbreviation)

第1章 文献综述

1．1 乙型脑炎病毒简介

1．2 乙型脑炎的流行病学特性

1．2．1 乙型脑炎的流行特征

1．2．2 乙型脑炎的传播特征

1．3 乙型脑炎的致病机制

1．3．1 JEV在机体内的增殖与扩散

1．3．2 JEV引起神经炎症反应的分子机制

1．4 乙型脑炎病毒的分子生物学特性

1．4．1 基因组结构与功能

1．4．2 蛋白质功能

1．4．3 病毒的入侵和复制过程

1．5 乙型脑炎临床症状与病理变化

1．5．1 乙型脑炎的临床症状

1．5．2 乙型脑炎的病理变化

1．6 乙型脑炎的防治

1．7 乙脑病毒蛋白与宿主蛋白相互作用的研究进展

1．7．1 JEV蛋白与宿主蛋白的相互作用对病毒入侵的影响

1．7．2 JEV蛋白与宿主蛋白的相互作用对病毒复制的影响

1．7．3 JEV蛋白与宿主蛋白的相互作用对神经炎症反应的影响

1．7．4 JEV蛋白与宿主蛋白的相互作用对天然免疫的影晌

1．8 病毒蛋白与宿主蛋白相互作用的研究方法

1．8．1 酵母双杂交系统

1．8．2 串联亲和纯化(TAP)

第2章 乙型脑炎病毒NS5蛋白与Hsp70相互作用的研究

2．1 前言

2．2 材料和方法

2．2．1 材料

2．2．2 实验方法

2．3 结果与分析

2．3．1 利用串联亲和纯化与质谱分析结合法筛选与JEV NS5蛋白相互作用的宿主蛋白

2．3．2 JEV NS5与宿主蛋白相互作用的验证

2．3．3 Hsp70蛋白可以与JEV NS5的RdRp结构域直接相互作用

2．3．4 Hsp70与JEV复制复合体组成成分相互作用

2．3．5 Hsp70正调控JEV基因组的复制

2．3．6 Hsp70可稳定JEV复制复合体的组成成分

2．3．7 JEV感染刺激Hsp70蛋白的表达

2．4 讨论

2．5 小结

第3章 JEV NS5蛋白抑制宿主蛋白入核运输的研究

3．1 前言

3．2 材料与方法

3．2．1 材料

3．2．2 实验方法

3．3 结果与分析

3．3．1 JEV抑制含经典NLS的报告蛋白入核

3．3．2 JEV NS5蛋白抑制3×SV40NLS-2×EGFP的入核

3．3．3 JEV NS5与核转运蛋白KPNA2、KPNA3、KPNA4相互作用

3．3．4 JEV NS5抑制p50与p65的核定位

3．3．5 JEV NS5抑制NF-κB的活性

3．3．6 JEV NS5通过直接靶向p50／p65来抑制NF-κB的活性

3．3．7 JEV NS5抑制p50／p65与KPNA3、KPNA4的相互作用

3．3．8 JEV NS5通过靶向KPNA2、KPNA3、KPNA4抑制Ⅰ型干扰素的分泌

3．3．9 KPNA2、KPNA3、KPNA4的过表达抑制JEV的复制

3．4 讨论

3．5 小结

第4章 依那西普对乙型脑炎的治疗作用的研究

4．1 前言

4．2 材料与方法

4．2．1 实验材料

4．2．2 实验方法

4．3 结果与分析

4．3．1 依那西普降低JEV感染神经元／胶质细胞引起的炎症反应

4．3．2 依那西普减轻JEV感染小鼠脑组织的病理症状

4．3．3 依那西普降低JEV感染小鼠脑部炎症因子的分泌

4．3．4 依那西普对JEV感染小鼠脑组织中胶质细胞和神经元形态和数量的影响

4．3．5 依那西普减少JEV感染小鼠脑组织中神经元的凋亡

4．3．6 依那西普抑制JEV感染引起的炎症与凋亡信号通路的激活

4．3．7 依那西普可缓解JEV感染所引起的血脑屏障通透性的改变

4．3．8 依那西普可降低小鼠脑组织中的病毒载量

4．3．9 依那西普可减轻JEV感染小鼠的临床症状并降低其致死率

4．4 讨论

4．5 小结

结论

参考文献

个人资料

教育经历

工作经历

发表的论文

其他论文

待发表论文

致谢