绵羊DLK1-GTL2印迹区域miRNAs对DLK1基因亲和力的研究

摘要

DLK1-GTL2印记区域在人、小鼠等多个物种的胚胎发育过程起重要作用，而该区域发现的一个A/G突变被认为是导致美臀(Callipyge，CLPG)羊后肢肌肉肥大表型的致因突变。遗传获得父源Callipyge突变的杂合子后代才能表现出肌肉肥大表型，而同时获得父源和母源Callipyge突变的纯合子个体表型为“野生型”，这种非孟德尔式的遗传方式被称作极性超显性。根据多年的研究推断Callipyge突变发挥顺式调控和反式调控作用来调节基因表达，而这种调节及其诱发Callipyge表型的潜在机制仍然不得而知。DLK1和PEG11被认为是诱发Callipyge肌肉肥大表型的功能基因，antiPEG11转录本加工形成的miRNA对PEG11转录本切割的反式调控已经得到证实，但是针对DLK1的反式调控机制尚不清楚。Callipyge突变的纯合子个体与Callipyge突变个体相比，骨骼肌组织中DLK1蛋白水平和核酸水平的表达分别下降～10和～3倍，而鉴于miRNA基因往往在转录后水平影响靶基因的表达，因此DLK1-GTL2印记区域表达的miRNA成为参与DLK1反式调控的首要候选。本研究中以蛋白定量方式研究了DLK1-GTL2印记区域表达的miRNA对DLK1的亲和力进行评估，主要研究结果如下:
　　1.利用cDNA末端序列快速扩增(Rapid amplification of cDNA end，RACE)方法鉴定Callipyge羊背最长肌中表达丰度最高的DLK1转录本，结果发现DLK1基因C2转录本的转录起始位点位于起始密码子ATG上游174个碱基对(base pair，bp)，一个占优势的多聚腺苷化位点位于终止密码子TGA下游236 bp。
　　2.在RACE结果的基础上，我们构建了1405 bp的全长“DLK1”cDNA片段，将其插入到稍作改造的pcDNA3.1(-)表达载体，由此构建p3.1M-DLK1-HA表达载体用于miRNA对DLK1亲和力研究中DLK1蛋白的表达。
　　3.通过对Callipyge羊背最长肌小RNA测序数据的分析，选择并合成121个miRNA模拟物用于该研究。
　　4.在COS1细胞中共转染DLK1表达质粒，绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein，GFP)表达质粒（用于转染效率的校正），和miRNA模拟物，然后通过双荧光Western blot的方法评估DLK1的表达水平变化，从而建立了DLK1的荧光报告实验方法。评估单个miRNA对DLK1的亲和力发现，在检测的121个miRNA模拟物中，与两个阴性对照的平均值相比，miR-329a-3p引起DLK1表达量下降1.25倍(p=3.8×10-4)。而与miR-329a-3p相比仅3'末端2个碱基差异的miR-329b-3p，与总体均值相比，仅DLK1表达仅下调1.1倍(p=0.047)。miR-329a-3p和miR-329b-3p与全长DLK1匹配位点序列在进化上是不保守的。在小RNA的测序实验中，miR-329a-3p和miR-329b-3p表达量分别占CLPG/CLPG个体骨骼肌中DLK1-GTL2区域的miRNA总量的0.0014％和0.19％。
　　5.121个miRNA模拟物对DLK1亲和力评估结果的生物学相关性研究发现，尽管miR-329a-3p对DLK1表现显著抑制效应，但是基于如下四个理由，我们认为并不足以声称是生物学相关的。第一，检测的121个miRNA连同2个阴性对照的效应是近似正态分布的，与预测到的对DLK1的亲和力是不相关的。第二，对DLK1具有正效应的miRNA比抑制效应的miRNA的个数还要多（根据已知的miRNA作用机制，这不能反应真实的生物学活性）。第三，当miR-329a-3p与密切相关的miR-329b-3p联合评估时，效应不显著。第四，绵羊骨骼肌中miR-329a-3p的表达丰度是极低的。因此，可以明确的说，至少在本研究所用的条件下，没有一个检测的miRNA能够独自下调DLK1表达至可与体内CLPG/CLPG绵羊体内观察到的下调效应相比较的水平。
　　尽管本研究我们未能发现某个miRNA能够反式抑制DLK1的表达正如体内观察到的一样，但是该结果同样为DLK1的反式调控机制研究提供了重要的参考资料，也为整个Callpyge表型形成的分子机制研究提供了重要的支持。本研究是第一次通过高通量的蛋白质定量方法研究了miRNA与同一个靶基因的互作，并未发现miRNA与预测到的对DLK1亲和力之间的相关，这揭示miRNA与靶基因的互作比我们了解的更复杂，这为相关研究提供了借鉴。

目录

论文说明

声明

摘要

缩略词表(Abbreviation)

1 前言

1．1 研究问题的由来

1．2 文献综述

1．2．1 Callipyge及其研究进展

1．2．2 DLK1-GTL2区域相关miRNA的研究进展

1．3 研究目的和意义

2 材料与方法

2．1 本研究的技术路线

2．2 材料

2．2．1 样品

2．2．2 用于DLK1亲和力评估的DLK1-GTL2区域miRNA模拟物

2．2．3 用于DLK1亲和力评估的DLK1的转录本序列

2．2．4 构建GTL2表达载体的GTL2转录本序列

2．3 方法

2．3．1 绵羊DLK1基因的RACE扩增

2．3．2 表达载体的构建

2．3．3 miRNA模拟物系统的选择

2．3．4 miRNA模拟物的分子设计

2．3．5 模拟物序列的选择

2．3．6 细胞培养和瞬时转染

2．3．7 双荧光Western blotting

2．3．8 DLK1蛋白的去糖基化处理

2．3．9 DLK1转录本的Northern blot分析

2．3．10 miRNA对DLK1亲和力的计算

3 结果

3．1 绵羊DLK1基因C2转录本的表达载体的构建和鉴定

3．2 成熟miRNA表达的设计

3．3 DLK1-GTL2区域单个miRNA对DLK1亲和力的测定

3．4 121个miRNA对DLK1亲和力评估结果的生物学相关性

3．5 GTL2对DLK1的可能调控作用研究

4 讨论

4．1 DLK1双荧光western blot检测方法的建立

4．2 DLK1-GTL2印记区域miRNA的功能分析

4．3 DLK1-GTL2区域的miRNA中对DLK1亲和力的研究

5 结论

5．1 本论文的主要研究结果及结论

5．2 本研究的创新点与特色

5．3 本研究的不足之处及值得进一步研究的问题

6 其它工作：猪TCAP基因的克隆与表达谱分析

6．1 文献综述

6．1．1 骨骼肌形成过程中的肌节组装

6．1．2 TCAP基因研究进展

6．2 材料与方法

6．2．1 材料

6．2．2 方法

6．3 结果

6．3．1 猪TCAP基因的分子克隆和鉴定

6．3．2 猪TCAP基因的表达谱分析

6．3．3 猪TCAP基因多态性和等位基因频率的检测

6．4 讨论

参考文献

致谢

附录