水稻全生育期基因表达谱构建与侧生分枝发育的基因调控网络研究

摘要

植物的生长发育过程受到基因表达方式的严格调控。剖析基因表达模式，不仅可以解释植物生长发育的机制，而且可以用于指导农作物的遗传改良。水稻作为世界上最主要的粮食作物之一，同时也是单子叶植物研究的模式物种，对其进行基因转录组的研究，既有利于理解植物发育的调控机制，也可以为其它多种作物的研究提供帮助。植物株型很大程度上由侧生分枝的发育决定的。水稻中侧生分枝包含营养生长时期的分蘖和生殖生长时期的穗分枝，这两种分枝深刻的影响水稻的产量，因此是水稻遗传改良的重要目标性状。本研究通过构建覆盖39个器官的转录组，建立了覆盖水稻全生育期的表达谱，并且和拟南芥的转录组进行了比较研究，发现了大量的与穗分枝发育有关的基因。通过对这些基因的功能研究，发现了一个主要由小RNA和转录因子组成的基因调控网络协同调控了水稻侧生分枝的发育。
　　本研究主要内容包括：⑴利用Affymetrix GeneChip Rice Genome Array对两个籼稻品种珍汕97和明恢63进行转录组分析，构建了覆盖全生育39个组织的基因表达谱，并且通过多种方式验证了数据的质量。这些数据建立了一个新的水稻功能基因组研究的平台。⑵通过表达谱分析了各个组织在发育上的关系，发现基因表达模式和器官发育的同源性之间有很好的对应关系。雄蕊跟别的器官具有截然不同的基因表达模式，而愈伤和根细胞之间具有发育上的相关性。⑶通过比较处于连续4个发育阶段的幼穗的转录组，发现了2667个基因存在差异表达。同时发现有两组基因从幼穗发育早期到后期，表现出相反的表达模式。第一组基因从早期到后期幼穗中，逐渐下调表达，其中包含了多个已经克隆的控制穗型态发育的基因，暗示这组基因可能与穗部枝梗发育有关。3个受到miR156调控的SPL基因也出现在第一组基因中。而第二组基因则从早期到后期的幼穗中逐渐上调表达，其中包含有多个与花器官发育有关的MADS基因。对两组基因进行GO分析发现转录因子都被富集了，说明转录水平的调节在穗型态发育过程中有着重要的作用。⑷分别鉴定到2376个组织特异表达和7276个组成型表达基因，并且发现19个不受遗传背景、生长环境、外界刺激等影响的最稳定表达的基因。⑸通过表达谱的相似性，建立了水稻和拟南芥器官之间发育的对应关系，并且发现11对双向最匹配的器官。在这些器官中，两个物种的直系同源基因表达丰度是保守的，但是超过一半的基因发生了表达模式的分化，说明很多直系同源基因在两个物种中可能发生了功能分化。⑹比较了水稻和拟南芥组织特异表达基因和组成型表达基因，发现具有组织特异表达特点的基因往往也是物种特异的，而组成型表达基因则有大量的保守基因，并且组织表达特异的直系同源基因具有更快的进化速度。⑺超量表达miR156导致分蘖极大增多，但是穗部分枝被严重抑制;而抑制miR156则得到了和超量表达相反的表型，说明miR156正调控分蘖发育，但是负调控花序分生组织活性。因为被miR156调控的SPL7，SPL14和SPL17都从幼穗发育的早期到后期逐渐下调表达，因此推测这三个SPL基因可能调控了水稻的侧枝发育。⑻水稻中miR529与miR156共同调控SPL基因，超量表达miR529得到了和超量表达miR156相似的表型。⑼SPL7单突变不影响水稻的株型;而抑制SPL14或者SPL17则可以得到和超量表达miR156或者miR529类似的表型，分蘖增加，穗部枝梗减少，说明SPL基因抑制分蘖发育，但是促进花序分生组织活性。SPL14和SPL17双RNAi的材料增强了表型变化，说明SPL基因可能是冗余控制水稻发育的。超量表达SPL7，SPL14和SPL17都导致分蘖的减少，但是穗部枝梗也减少，特别是每个一次枝梗上分化的二次枝梗数量，表明SPL还促进小穗分生组织的分化。超量表达SPL基因可以部分恢复miR156超量表达的表型。⑽超量表达miR172不影响分蘖发育，但是导致穗部一次枝梗减少，并且每个一次枝梗上分化的二次枝梗也减少;而抑制miR172的表达也不影响分蘖发育，但是导致一次和二次枝梗都增加，说明miR172负调控花序分生组织活性，但是促进小穗分生组织的分化。抑制miR172的靶基因AP2类的SNB和OsTOE1得到了类似miR172的表型变化;而超量表达SNB和OsTOEI则和抑制miR172的表型类似，说明miR172对穗型的调控作用是通过靶基因实现的。⑾植物体内实验证明AP2类基因编码转录抑制子，并且包含有转录抑制模体EAR结构。体内体外实验证明AP2类蛋白质可以和转录共抑制子ASP1互作，并且分别是AP2的EAR结构和ASP1的CTLH结构域介导了这种互作。遗传分析结果证明了ASP1对AP2类基因调控穗分枝发育是必需的。⑿基因表达分析表明miR156和miR172具有互补的表达模式，并且在SPL超量表达材料中，miR172及其前体基因pri-miR172b和pri-miR172d上调表达。利用ChIP，酵母单杂交和EMSA证明了SPL14可以直接调控miR172的表达。遗传学分析进一步证明了SPL基因是通过miR172促进小穗分化的。⒀PAP2/MADS34也通过抑制RCN基因促进小穗分化。基因表达分析表明SPL基因正调控PAP2/MADS34的表达，并且ChIP和EMSA证明SPL14可以直接调控PAP2/MADS34的表达，表明SPL基因也可可能通过PAP2/MADS34-RCN的途径促进小穗的分化。遗传分析证明RCN1可以恢复SPL基因超量表达导致的小穗分化的异常。⒁通过比较miR156超量表达植株和野生型的幼穗，发现了大量的基因发生了差异表达，包括很多已知的控制穗型发育的基因，如LAX1和RFL，并且这些基因同SPL基因共表达，说明SPL基因也可能通过这些基因调控穗分枝。遗传学分析证明了LAX1和RFL对SPL基因的功能是必需的，并且酵母单杂交和EMSA证明SPL14可以结合LAX1的启动子。⒂Ghd7调控SPL基因的表达，并且遗传学分析表明SPL基因的活性对Ghd7调控株高和穗分枝发育是必需的，但是Ghd7对抽穗期的作用独立于SPL基因。

目录

声明

摘要

缩略词表

第一章 水稻全生育期基因表达谱的构建

1 前言

1．1 研究问题的由来

1．2 基因表达研究技术进展

1．3 基因芯片和二代测序技术在植物转录组研究中的应用进展

1．4 研究的目的与意义

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．2 实验方法

3 结果与分析

3．1 全生育期基因表达谱分析的样品获取

3．2 基因表达谱芯片的获取和数据库的构建

3．3 表达谱数据质量分析

3．4 各个组织表达基因的数量

3．5 各个组织表达基因的特点

3．6 不同功能基因的表达丰度分析

3．7 不同组织之间基因表达模式的相关性分析

3．8 表达基因的功能与特定组织生物学功能的相关性分析

3．9 幼穗发育过程基因的动态表达分析

3．10 组织特异表达基因鉴定

3．11 组成型表达基因的鉴定

3．12 恒量表达基因鉴定

3．13 水稻和拟南芥各组织在发育上的对应关系

3．14 直系同源基因在水稻和拟南芥中表达模式的比较

3．15 水稻和拟南芥组织特异表达基因及组成型表达基因的比较

3．16 水稻和拟南芥组织特异表达基因和组成型表达基因的进化速率的比较

4 讨论

4．1 水稻基因表达谱是一种重要的数据资源

4．2 转录水平的调控对穗型建成发挥着重要作用

4．3 雄蕊具有独特的基因表达模式

4．4 新鉴定的稳定表达基因的利用

第二章 水稻侧生分枝发育的基因调控网络研究

1 前言

1．1 研究问题的由来

1．2 水稻分蘖和穗分枝发育研究进展

1．3 miR156及其靶基因SPL的功能研究进展

1．4 miR172及其靶基因AP2的功能研究

1．5 研究的目的与意义

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．2 实验方法

3．结果与分析

3．1 水稻miR156，miR529和SPL基因的功能研究

3．2 水稻miR172和AP2类基因的功能研究

3．3 SPL基因调控穗发育的机制

4 讨论

4．1 miR156，miR172和miR529对水稻分枝发育的协同调控

4．2 SPL基因在水稻分枝发育中多效性

4．3 miR172-AP2控制穗分枝发育可能的机制

5 展望

5．1 SPL基因调控分蘖的机制是什么?

5．2 miR156-SPL基因的表达量随发育进程而改变的机制是什么?

5．3 miR172-AP2控制株型的机制是什么?

5．4 如何在育种中利用这些基因来改良品种?

参考文献

附录

作者简介

致谢