基于一下代测序的玉米高通量SNP开发及关联分析

摘要

玉米是重要的粮食作物和饲料来源，品质和产量一直以来是遗传育种的主要目标。本研究以玉米籽粒油份含量、穗长等复杂数量性状为研究对象，利用下一代测序技术开发高密度单核苷酸多态性(SNP)标记用于全基因组关联分析，寻找影响复杂性状遗传变异的关联位点，为玉米遗传育种提供丰富的候选关联SNP标记及基因。主要研究结果如下:
　　1.构建实验室Illumina高通量测序平台，进行全基因组重测序、简化基因组测序(Genotyping By Sequencing，GBS)以及RNA-seq测序。现已完成522份玉米关联群体、TEO/MO17重组自交系(RIL)中10份典型材料及186份芒草植株的文库构建、高通量测序及基因型鉴定工作。
　　2.在本实验室已构建具有广泛遗传多样性的关联群体基础上，利用GBS测序技术在522份玉米自交系中开发了670，412个SNP标记，并结合实验室已有368份材料RNA-seq鉴定得到的3M SNP标记、50K及600K基因芯片SNP标记进行比较和补缺分析，整合为一套完整的基因型数据。最后获得541份材料2.65M非重复的SNP标记，其中1.25M标记的最小等位基因频率(MAF)≥0.05。
　　3.利用整合后1.25 M的标记对籽粒油份含量进行全基因组关联分析，与RNA-seq0.56 M标记结果对比，在全基因组显著水平下(P＜9.83×10-7)，与已报道的26个显著位点相比，有19个被再次检测到;同时，检测到了18个新位点，其中7个(1/3)处于非基因区间，14个与表达量QTL(eQTL)共定位。以第4号染色体上8个紧密连锁的显著SNP标记为例，其均位于非基因区间，且与eQTL共定位区间存在远程调控三个候选基因（GRMZM2G066618，GRMZM2G162670，GRMZM2G125556）的表达，三个候选基因在拟南芥中的同源基因均参与油脂合成代谢途径。
　　4.利用整合后1.25M基因型标记对穗长和雄穗主轴长进行全基因组关联分析，与原RNA-seq0.56M基因型对比，在全基因组显著水平下(P＜9.83×10-7)，分别在1号及2号染色体上检测到显著性关联位点。同时，分别得到连锁群体YU87-1/BK及TEO/MO17 RIL群体QTL验证，并由此预测影响穗长和雄穗主轴长表型变异的候选基因。该研究为候选基因的进一步功能验证及作用机理解析奠定了坚实的基础。

目录

声明

摘要

缩略语表

1 前言

1．1 高通量测序技术体系和主要应用

1．1．1 高通量测序技术原理

1．1．2 全基因组重测序

1．1．3 简化基因组测序

1．1．4 转录组测序

1．2 关联分析和玉米关键性状的研究进展

1．2．1 关联分析

1．2．2 玉米籽粒油份含量及部分农艺性状的研究进展

1．3 本研究的意义和目的

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 关联群体材料

2．1．2 TEO／MO17 RIL群体中10份典型材料

2．1．3 合作项目芒草材料

2．2 高通量测序平台的构建

2．2．1 简化基因组测序GBS建库及其改进

2．2．2 关联群体材料的DNA质量控制、GBS建库及基因型鉴定

2．2．3 TEO／MO17 RIL群体中10份典型材料的Pair-end及Mate-pair建库

2．2．4 芒草DNA提取、质量控制、GBS建库和基因型鉴定

2．3 全基因组关联分析

2．3．1 表型测定、群体结构和亲缘关系评估

2．3．2 各基因型鉴定技术开发的SNP标记一致性比较、整合、推算及SNP注释

2．3．3 基于各基因型鉴定技术的全基因组关联分析

2．3．4 基因注释、功能预测、新显著位点的确定及候选基因提名

3 结果分析

3．1 高通量测序结果分析

3．1．1 关联群体GBS技术开发SNP变异结果的统计及初步验证

3．1．2 芒草材料GBS基因型鉴定

3．2 影响玉米复杂性状变异位点的鉴定和分析

3．2．1 各基因型鉴定技术SNP标记一致性验证及推算结果

3．2．2 整合基因型的优势体现

3．2．3 基于各基因型鉴定技术结合籽粒油份含量的GWAS结果比较

3．2．4 利用整合基因型的GWAS鉴定影响籽粒油份含量的新位点

3．2．5 非基因区间的新位点影晌籽粒油份含量变异

3．2．6 非基因区间油份含量显著关联的新位点与eQTL共定位分析

3．2．7 调控油份含量变异的候选基因功能注释

3．2．8 与穗长变异显著关联的位点及与QTL共定位分析

3．2．9 与雄穗主轴长变异显著关联的位点及与QTL共定位分析

4 讨论

4．1 简化基因组测序GBS建库方法

4．2 GBS pipeline鉴定SNP标记

4．3 各基因型鉴定技术的差异

4．4 影响GWAS效应的因素

4．5 影响关键性状的候选基因

5 主要结论

参考文献

附录

致谢