利用病毒诱导基因沉默技术快速筛选棉花抗黄萎病相关基因

摘要

我国棉花黄萎病是由大丽轮枝菌引起的土传真菌维管束病害，对棉花纤维产量与品质影响严重。鉴定抗病基因并通过分子育种培育具有抗黄萎病棉花品种是棉花抗病育种工作的重要策略。开发并利用基因功能快速筛选方法是鉴定棉花抗病基因的迫切需求。
　　本研究针对棉花SSN-RNAi转基因植株与野生型植株‘YZ1’根部组织为材料的RNA-seq差异表达谱中的6个差异表达基因开展了抗病功能的快速筛选。结合本实验室海岛棉基因组测序结果，将这6个基因分别命名为GbMIC5、NH2、GbGLIP1、GbPK1、GbGSTU7和GbGSTU8。表达分析发现，这些基因均在棉花根中高效表达。分别构建各基因的重组载体并通过病毒诱导基因沉默(Virus-induced gene silencing, VIGS)技术体系抑制其在海岛棉品系‘海7124’中的表达。接种试验表明，与对照TRV:00相比，TRV:GbMIC5、TRV:GbGLIP1、TRV:GbGSTU7和TRV:GbGSTU8等基因沉默植株更加感病。我们推测GbMIC5、GbGLIP1、GbGSTU7和GbGSTU8参与了棉花与黄萎病菌互作过程，并正调控棉花对黄萎病菌抗性。基因沉默植株TRV:NH2与对照相比发病程度较低，但发病率并无差异。说明NH2可能对黄萎病菌在棉株维管束中的扩展起到一定程度促进作用。此外，对筛选结果中可能正调控棉花对黄萎病菌抗性的GbGSTU7和GbGSTU8研究发现，GbGSTU7和 GbGSTU8属于谷胱甘肽转移酶基因家族成员。瞬时烟草转化显示GbGSTU7和GbGSTU8的亚细胞定位于细胞质中。棉花受黄萎病菌胁迫早期GbGSTU7表达水平并没有明显变化，而GbGSTU8受接种诱导上调表达。随后分别构建GbGSTU7和GbGSTU8的超表达、干涉载体，开展棉花遗传转化研究。

目录

声明

缩略语表

1 文献综述

1.1 植物免疫系统概述

1.2 棉花抗黄萎病研究进展

1.3 病毒诱导的基因沉默及其应用

1.4 本研究目的与意义

2 材料与方法

2.1 材料、菌株和载体

2.2 实验方法

3 结果与分析

3.1 棉花抗病候选基因的表达鉴定

3.2 各基因组织表达模式

3.3 VIGS 重组载体构建

3.4 VIGS 处理棉花幼苗后表型结果

3.5 各基因的干涉棉株对黄萎病菌抗性分析

3.6 GbGSTU7 和GbGSTU8 基因克隆与序列分析

3.7 GbGSTU7和GbGSTU8的亚细胞定位

3.8 GbGSTU7 和GbGSTU8在生物胁迫下的表达分析

3.9 GbGSTU7 和GbGSTU8 超表达、干涉载体构建

4 讨论

4.1 VIGS技术在棉花抗病基因鉴定中的优点与不足

4.2 利用VIGS分别干涉各候选基因对棉花抗病的影响

参考文献

附录

致谢