棉花病毒诱导的基因沉默体系的建立及其在棉花抗黄萎病中的应用

摘要

棉花黄萎病是一种由大丽轮枝菌引起的对棉花危害较大的世界性病害之一。近几年来，黄萎病在我国南北方棉区蔓延迅速，为害也在逐年加重，成为棉花生产中的主要障碍。目前对棉花黄萎病抗性的分子机理研究仍不是很清楚，发掘抗黄萎病优异基因可加速棉花抗病育种进程。而基于病毒诱导的基因沉默方法将目标基因沉默并观察其对棉花黄萎病抗性的影响，在研究棉花抗黄萎病的分子机制中有着重要的意义。本研究系统开展了棉花病毒诱导的基因沉默体系的建立及其在棉花抗黄萎病中的应用。
　　主要研究结果如下:
　　1.构建棉花CLA1（Cloroplastos alterados 1 gene）基因的沉默载体，利用TRV病毒载体建立基于病毒诱导的棉花基因沉默体系(VIGS)。通过农杆菌注射法观察不同浓度的农杆菌对沉默效率的影响，明确农杆菌浓度在0.1～3.0之间都可以获得良好的沉默效果，通过对30个不同来源的棉花品种进行VIGS体系对受体的选择性分析，结果表明VIGS诱导的棉花功能基因沉默体系受受体遗传背景影响不大。病毒基因TRV-RNA2的RT-PCR分析证明子叶接种病毒侵染后，该病毒可到达受体的根、茎、叶等器官，说明该技术可应用于不同组织器官来源基因验证的广谱性。
　　2.MAPK级联途径与多种生物和非生物胁迫的反应相关。本研究克隆了棉花丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号转导途径中两个基因GhMAPK，GhMAPKKK。构建沉默载体，通过病毒诱导的基因沉默的方法证明GhMAPKKK在棉花抗黄萎病过程中具有一定的作用。通过RT-PCR实验分析，证明了在注射2周后GhMAPK，GhMPAKKK基因的表达量明显降低，从分子水平上验证该基因被成功的沉默。

目录

声明

摘要

缩略词表

第一章 大丽轮枝菌与棉花的互作机制

1 棉花黄萎病

1．1 症状

1．2 发病规律

2 病原菌

2．1 寄主范围

2．2 侵染循环

2．3 致病机制

3 棉花的防御机制

3．1 棉花对黄萎病的组织结构抗性

3．2 棉花对黄萎病的生理生化抗性

第二章 MAPK途径的作用机制

1 植物体内的MAPK级联途径

2 植物体内MAPK途径的特点

3 植物中MAPK的分类

4 MAPK与植物病原信号传递

第三章 病毒诱导的基因沉默

1 病毒诱导基因沉默的作用机制

2 VIGS病毒载体

3 烟草脆裂病毒

4 VIGS的应用

本研究的目的和意义

第四章 棉花病毒诱导的基因沉默体系的建立

1 实验材料

1．1 植物材料

1．2 菌株与质粒

1．3 酶与各种生化试剂

1．4 常用溶液及培养基

2 实验方法

2．1 CTAB-PVP法提取棉花总RNA

2．2 RNA的纯化

2．3 cDNA第一条链的合成

2．4 目的基因的克隆

2．5 PCR扩增产物的电泳、回收、连接

2．6 回收产物连接

2．7 大肠杆菌感受态细胞的制备和转化

2．8 载体的构建

2．9 农杆菌介导基因沉默

2．10 半定量实验

3 结果分析

3．1 棉花叶片总RNA的提取与鉴定

3．2 TRV在棉花植株中的扩散

3．3 pTRV-GhCLA1沉默载体的构建

3．4 不同浓度的农杆菌对沉默效果的影响

3．5 TRV载体在不同棉花品种之间的差异

3．6 农杆菌侵染后棉花RNA的提取及半定量RT-PCR分析

4 讨论

第五章 沉默GhMAPK和GhMAPKKK对棉花黄萎病抗性的影响

1 实验材料

2 实验方法

2．1 大丽轮枝菌的培养及接种

3 结果分析

3．1 pTRV载体的构建

3．2 目的基因的诱导表达分析

3．3 半定量RT-PCR分析基因沉默效果

3．4 沉默目的基因对棉花黄萎病抗性的影响

4 讨论

全文总结

参考文献

附录

1 TRV沉默载体图谱

2 棉花GhCLA1基因序列

3 棉花黄萎病病情考查分级标准

4 棉花编号与品种对照表

致谢