二、四倍体泥鳅基因组DNA甲基化的比较研究

摘要

多倍化是生物进化过程中的一种自然现象，也是推动生物进化的主要动力之一。多倍体化后会造成物种基因组中大量功能基因的重复，这些重复基因的演化机制已经成为分子进化领域研究的热点。表观遗传变异（Epigenetic variation）是指在基因组的DNA序列没有发生改变的情况下，基因功能发生了可遗传的变化，并最终导致表型的变化。DNA甲基化在控制冗余基因的表达和保持多倍体基因稳定方面起着重要的调节作用，是研究多倍体表观遗传现象的最佳途径之一。通常认为，DNA甲基化水平的提高会抑制基因的表达，而去甲基化则会激活某些基因的表达。然而，目前相关的研究主要集中在植物中。鱼类是脊椎动物的最大类群，其多倍体现象也非常普遍，鱼类多倍化后DNA甲基化修饰变化及其对基因表达调控的研究却非常有限。
　　泥鳅(Misgurnus anguillicaudatus)是我国常见的小型淡水经济鱼类。已有的研究结果表明，泥鳅的染色体存在广泛的核型多态性。我国的野生泥鳅主要为二倍体（2n=50）群体，但在长江流域，人们还发现有大量的天然四倍体(4n=100)群体。通过人工诱导雌核发育和雄核发育，研究人员认为，这些染色体数目为100的个体为同源四倍体。本研究以天然二倍体和四倍体泥鳅为材料，采用高效液相色谱法（HPLC）分析不同倍性泥鳅是否在基因组整体甲基化水平上存在差异；然后建立适合于泥鳅基因组的甲基化敏感扩增多态性技术体系（MSAP），在全基因组水平检测二、四倍体泥鳅DNA甲基化修饰位点，分析多倍体与二倍体泥鳅甲基化水平差异及模式变化特征，进而探讨DNA甲基化对多倍体泥鳅基因的表达调控作用。研究结果如下：
　　1.采用HPLC技术比较了二倍体和四倍体泥鳅的肌肉、鳍条和肝脏的基因组DNA整体甲基化水平。结果显示，二倍体泥鳅肌肉、鳍条和肝脏的总体甲基化水平分别为19.53％±3.14%、20.62%±2.59%和17.60%±1.85%，而四倍体泥鳅相应组织的甲基化水平为17.31%±1.18%、17.10%±2.03%和15.34%±1.15%。表明，相同倍性泥鳅肌肉和鳍条组织的DNA甲基化水平相似(P＞0.05)，但显著高于肝脏(P＜0.01)。倍性间比较显示，二倍体泥鳅肌肉、鳍条和肝脏的甲基化水平均比四倍体高(P＜0.01)，表明DNA甲基化水平差异不仅与倍性有关，而且与组织有关。
　　2.取二、四倍体泥鳅的血液，提取基因组DNA，采用MseⅠ和HpaⅡ对其进行双酶切，建立适合于泥鳅基因组的甲基化敏感扩增多态性分析体系（MSAP），用该技术体系对二、四倍体泥鳅DNA序列中5'-CCGG位点甲基化进行特异性扩增，在全基因组水平检测二、四倍体泥鳅DNA甲基化修饰位点，分析多倍体与二倍体泥鳅甲基化水平差异及模式变化特征。结果显示，所筛选到的16对引物在二倍体、四倍体泥鳅中分别扩增出439、474条条带。四倍体泥鳅基因组DNA全甲基化率（15.61%）和半甲基化率（18.35%）均高于二倍体泥鳅（14.58%和17.08%）。DNA甲基化模式比较结果显示，二、四倍体泥鳅相比单态型位点共有348个，占全部带型的71.61%；与二倍体相比，四倍体泥鳅发生去甲基化频率为10.59%，过甲基化频率为13.58%，次甲基化位点频率为4.32%。该结果表明，与二倍体相比，四倍体泥鳅在甲基化水平及甲基化模式上均发生了明显的变化。
　　3.在MSAP扩增图谱上，选择在二、四倍体泥鳅中稳定出现的差异片段，对差异片段进行回收、克隆和测序，并与NCBI数据库进行比对，筛选染色体加倍过程中，DNA甲基化变异相关的基因。本研究共回收到14个甲基化差异片段， NCBI中比对结果显示，7个片段与斑马鱼、青鳉、鲤鱼的一些新蛋白基因、反转录因子、细胞分裂相关基因等具有较高的同源性，但也有部分序列没能找到同源序列，推测可能是由于泥鳅基因组序列信息不足，也有可能是一些新的基因目前尚未报到。

目录

1. 文献综述

1.1 多倍体鱼类研究现状

1.1.1 泥鳅研究进展

1.1.2 自然多倍体鱼类研究进展

1.1.3 多倍体鱼类的鉴定

1.2 DNA甲基化研究进展

1.2.1 DNA甲基化机理

1.2.2 DNA甲基化的生物学功能

1.2.3 DNA甲基化在动植物多倍体中的研究进展

1.2.4 DNA甲基化研究方法

1.3本研究目的与意义

2. 二、四倍体泥鳅基因组DNA甲基化的HPLC分析

2.1材料和方法

2.1.1试验鱼的准备

2.1.2主要仪器和试剂

2.1.3泥鳅染色体倍性鉴定

2.1.4基因组DNA的提取

2.1.5基因组DNA水解条件的优化

2.1.6标准曲线的绘制

2.1.7 仪器检测

2.1.8 HPLC检测二、四倍体泥鳅基因组DNA甲基化

2.2 结果与分析

2.2.1泥鳅染色体倍性检测结果

2.2.2 基因组DNA检测结果

2.2.3 基因组DNA酸解的温度的选择

2.2.4 基因组DNA酸解时间的选择

2.2.5 泥鳅基因组DNA酸解条件的确定

2.2.6 标准曲线的绘制结果

2.2.7 仪器检测结果

2.2.8 二、四倍体泥鳅不同组织DNA甲基化水平比较

2.3 讨论

3. 二、四倍体泥鳅基因组DNA甲基化的MSAP分析

3.1 材料与方法

3.1.1试验鱼选择

3.1.2基因组DNA的提取及质量检测

3.1.2 MSAP分析二、四倍体泥鳅基因组DNA甲基化

3.1.3 二、四倍体泥鳅甲基化差异片段检测

3.2 结果与分析

3.2.1 基因组DNA提取结果

3.2.2 酶切反应结果

3.2.3 预扩增反应结果

3.2.4 选择性扩增反应结果

3.2.5泥鳅基因组DNA甲基化的MSAP分析

3.2.6 二、四倍体泥鳅基因组DNA甲基化水平比较

3.2.7二、四倍体泥鳅基因组DNA甲基化模式比较

3.2.8 二、四倍体泥鳅甲基化差异片段序列分析

3.3 讨论

3.3.1二、四倍体泥鳅基因组DNA甲基化水平比较

3.3.2二、四倍体泥鳅基因组DNA甲基化模式比较

3.3.3 二、四倍体泥鳅甲基化差异片段分析

参考文献

附录

致谢