运输应激条件下弓形虫缓殖子向速殖子转化差异蛋白的筛选及鉴定

摘要

刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)是一种专性细胞内寄生的原虫，可以引起严重的人畜共患寄生虫病。弓形虫宿主范围极其广泛，可以感染家禽、家畜、伴侣动物以及人类在内的所有温血动物。对于免疫功能健全的个体，弓形虫的感染不表现出明显的临床症状，虫体多以半休眠的组织包囊形式在宿主脑部、肌肉及眼部定居，与机体长期共存。但是包囊并不是无威胁的存在，当宿主的免疫力低下时，包囊会再活化，进而由缓殖子转变为速殖子，引起急性感染。因此，弓形虫速殖子和缓殖子的转化在弓形虫致病过程中扮演着关键的角色。研究表明，运输应激可以降低宿主的免疫力，从而导致多种疾病的复发，据此推测，弓形虫作为一种机会性致病病原体，运输应激可能诱发弓形虫慢性感染小鼠脑内包囊的再活化。
　　弓形虫速殖子和缓殖子转化过程中，多种期特异性蛋白、热休克蛋白以及代谢酶类的表达发生明显变化，它们对弓形虫的生长以及代谢有着重要的调控作用。因此，本研究针对弓形虫速殖子和缓殖子转化过程中可能的差异蛋白进行筛选及鉴定。
　　本研究首先建立运输应激诱导弓形虫缓殖子向速殖子转化的动物模型，验证了运输应激诱使包囊再活化，即由缓殖子转化成速殖子;随后模拟运输应激，利用细胞因子抗体芯片检测小鼠血清中细胞因子的变化，结果显示小鼠外周血血清中γ干扰素（IFN-γ），白细胞介素(IL-1α)，白细胞介素(IL-4)，白细胞介素（IL-10），白细胞介素(IL-12)以及巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)的表达水平在应激后显著下降;最后利用双向电泳以及质谱鉴定技术筛选并鉴定出了缓殖子向速殖子转化过程中的47个鼠源蛋白和15个弓形虫蛋白。具体工作包括以下几个方面:
　　(1)弓形虫缓殖子向速殖子转化动物模型的建立
　　利用运输应激成功诱导弓形虫脑包囊的再活化，即由缓殖子转变成速殖子。将弓形虫PRU株慢性感染小鼠模拟运输应激3天后，利用Real-time PCR分别检测弓形虫速殖子期特异性基因SAG1和缓殖子期特异性基因BAG1的mRNA相对表达水平。结果显示在运输应激3天后，BAG1的相对表达水平下降，SAG1的相对表达水平显著上升，表明运输应激诱导包囊的再活化，即从缓殖子向速殖子转化。
　　(2)运输应激影响弓形虫慢性感染小鼠的免疫水平
　　利用弓形虫缓殖子向速殖子转化的动物模型，分别收集运输应激前，应激1天，应激2天，应激3天的小鼠外周血血清，利用细胞因子抗体芯片检测小鼠细胞因子的变化。结果显示，IFN-γ，IL-1α，IL-4，IL-10，IL-12以及M-CSF6种细胞因子水平随着应激时间的延长逐渐下降，在应激3天后显著下降。表明运输应激降低慢性感染小鼠的免疫水平。
　　(3)弓形虫缓殖子向速殖子转化差异蛋白的筛选及鉴定
　　利用弓形虫缓殖子向速殖子转化的动物模型，分别收集并纯化运输应激前，应激1天，应激2天，应激3天的小鼠脑组织包囊，提取包囊总蛋白，利用双向电泳技术筛选缓殖子向速殖子转化过程中的差异蛋白并进行质谱鉴定。结果显示，47个鼠源蛋白和15个弓形虫相关蛋白的表达量在缓殖子向速殖子转化过程中显著变化;随后利用Real-time PCR验证了弓形虫肌动蛋白(Actin)，微线体蛋白13(MIC13)，致密颗粒蛋白9（GRA9），致密颗粒蛋白1(GRA1)和烯醇酶1(ENO1)的mRNA水平在运输应激后显著上升，与双向电泳结果一致，表明缓殖子向速殖子转化过程中多种宿主和虫体的蛋白表达发生变化。
　　本研究利用小鼠运输应激模型证实了应激导致机体免疫力下降;成功筛选并鉴定出了弓形虫缓殖子向速殖子转化过程中的47个鼠源蛋白和15个弓形虫相关蛋白，为阐明弓形虫速殖子和缓殖子转化机制提供了理论依据。

目录

声明

摘要

缩略语表

1 文献综述

1．1 弓形虫病及危害

1．2 弓形虫生活史

1．3 弓形虫与宿主免疫应答

1．4 弓形虫速殖子和缓殖子的体内外转化

1．4．1 弓形虫速殖子和缓殖子的体内转化

1．4．2 弓形虫速殖子和缓殖子的体外转化

1．5 弓形虫速殖子和缓殖子的差异

1．5．1 弓形虫速殖子和缓殖子形态结构上的差异

1．5．2 弓形虫速殖子和缓殖子分子水平上的差异

1．6 应激与机体免疫调节

1．6．1 应激与运输应激

1．6．2 应激与机体免疫调节

1．6．3 应激与疾病预后

2 研究目的与意义

3 材料与方法

3．1 实验材料

3．1．1 实验动物

3．1．2 弓形虫虫株

3．1．3 主要试剂

3．1．4 ELISA缓冲液

3．1．5 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)缓冲液

3．1．6 双向电泳试剂

3．1．7 酶标二抗

3．1．8 主要仪器

3．2 实验方法

3．2．1 PCR引物的设计和合成

3．2．2 弓形虫PRU株组织包囊的动物接种与收集纯化

3．2．3 运输应激的模拟

3．2．4 Total RNA的提取

3．2．5 Real-time PCR检测弓形虫BAG1和SAG1基因mRNA的相对表达水平

3．2．6 TCA-酚法提取蛋白

3．2．7 蛋白质浓度定量测定

3．2．8 模拟运输应激对弓形虫慢性感染小鼠细胞因子的影响

3．2．9 双向电泳实验样品的收集与处理

3．2．10 弓形虫包囊蛋白的双向电泳分析

3．2．11 双向电泳数据分析

3．2．12 差异蛋白的质谱分析

3．2．13 质谱结果分析鉴定

3．2．14 差异蛋白的Real-time PCR验证

4 结果与分析

4．1 弓形虫PRU株脑组织包囊的纯化与收集

4．2 弓形虫PRU株慢性感染小鼠模型的建立

4．3 运输应激诱发慢性感染小鼠脑组织包囊的再活化

4．4 运输应激条件下弓形虫慢性感染小鼠细胞因子的检测

4．4．1 荧光信号的采集

4．4．2 弓形虫慢陛感染小鼠细胞因子的变化

4．4．3 运输应激条件下弓形虫慢性感染小鼠细胞因子的变化

4．5 运输应激条件下弓形虫缓殖子向速殖子转化差异蛋白的筛选

4．5．1 运输应激条件下弓形虫PRU株脑组织包囊的纯化与收集

4．5．2 不同应激时间脑组织包囊的蛋白提取及浓度测定

4．5．3 不同应激时间包囊蛋白的SDS-聚丙烯酰胺分析

4．5．4 不同应激时间包囊蛋白的双向电泳分析

4．6 弓形虫缓殖子向速殖子转化差异蛋白的质谱鉴定

4．6．1 鼠源蛋白的质谱鉴定

4．6．2 弓形虫相关蛋白的质谱鉴定

4．6．3 差异蛋白的Real-time PCR验证

5 讨论

5．1 运输应激影响弓形虫速殖子和缓殖子的相互转化

5．2 运输应激影响弓形虫慢性感染小鼠的免疫水平

5．3 运输应激条件下弓形虫缓殖子向速殖子转化差异蛋白的筛选及鉴定

6 结论

参考文献

致谢

作者简介