喹赛多及其主要代谢物在肠、肝和肾细胞模型中转运体研究

摘要

做为一种喹噁啉类化合物，喹赛多(Cyadox，Cy0)对畜禽和鱼类具有明显的促生长和抗菌作用，与同类药物相比毒性作用小，安全性高，具有广阔的开发应用前景。体内分布和代谢研究表明喹赛多及其代谢产物广泛分布于肠道、肝脏和肾脏组织中。动物体内不同组织细胞如肠上皮细胞、肝细胞和肾细胞膜表面分布着丰富的药物转运体，如摄取型转运体OATP(有机阴离子转运多肽)、OAT(有机阴离子转运体)和OCT(有机阳离子转运体)以及外排型转运体MRP(多药耐药相关蛋白)和P-gp(多药耐药蛋白)，其能够主动摄取或外排相应的底物，从而影响药物的药代动力学特征。本课题开展喹赛多及其代谢物相关转运体的研究，将有助于进一步改善喹赛多的药代动力学特征和抗菌促生长作用。
　　药物转运体的研究方法包括细胞模型、原位/离体灌注模型和基因敲除动物模型等，其中应用最广泛的是细胞模型。为了阐明Cy0及主要代谢物Cy1（脱二氧喹赛多）、Cy2(N4-脱一氧喹赛多)和Cy10(N1-脱一氧喹赛多)在肠道、肝脏和肾脏中的跨膜转运机制，本课题组建立了IPEC-J2(猪空肠上皮细胞)、BRL(大鼠正常肝细胞)和PK15(猪肾上皮细胞)的摄取和双向转运模型，通过分别添加OATP抑制剂利福平、OAT抑制剂丙磺舒、OCT抑制剂西咪替丁、MRP抑制剂环孢素和P-gp抑制剂维拉帕米，考察对喹赛多及其代谢物的细胞摄取量和细胞单层转运量的影响，研究阐明喹赛多及主要代谢物跨膜转运过程中可能参与的转运体。
　　1、药物对细胞的最大无毒性作用剂量的筛选:在96孔板中通过MTT方法分别考察了8μmol/L、16μmol/L、32μmol/L、64μmol/L和128μmol/L的Cy0、Cy1、Cy2及Cy10和细胞共同孵育0.5h、1h、2h和4h对IPEC-J2细胞、BRL细胞和PK15细胞的生长活力的影响。结果显示作用浓度为32μmol/L，时间4h以内，Cy0、Cy1、Cy2和Cy10对IPEC-J2细胞存活率为81.02±5.62％、80.88±4.43％、83.23±2.23％、82.77±3.23％;对BRL细胞存活率为81.83±2.05％、88.28±1.43％、82.82±1.68％、85.52±1.05％;对PK15细胞的存活率为83.06±3.62％、83.15±2.05％、81.71±3.56、81.37±4.78％。结果表明喹赛多及其主要代谢物在32μmol/L和作用时间4h以内，三种细胞存活率均达到80％以上，因此确定32μmol/L做为药物对三种细胞的最大无毒性作用剂量。
　　2、细胞摄取和双向转运试验检测方法的建立:通过对药物的提取和色谱方法的优化，建立了Cy0及其代谢物Cy1、Cy2和Cy10在IPEC-J2细胞、BRL细胞和PK15细胞摄取和双向转运模型中的提取方法及HPLC检测方法。摄取试验细胞先在冰浴条件下超声破碎细胞，取30μL用BCA试剂盒进行蛋白浓度测定，剩余970μL加入1mL甲醇沉淀蛋白，在4℃条件下12000r/min离心后取上清溶液进行氮气吹干，加300μL初始流动相复溶进HPLC检测;而对于双向转运样品，加入等体积的甲醇后4℃条件下12000r/min离心，取上清溶液进行HPLC检测。Cy0流动相为乙腈∶0.5％甲酸水=13％∶87％，等度洗脱，紫外检测波长为306nm;而Cy1、Cy2和Cy10流动相为乙腈∶0.5％甲酸水=20％∶80％，等度洗脱，紫外检测波长为275nm，并对方法的专属性、回收率、准确度、精密度和线性进行考察。结果显示各目标化合物与细胞杂质及转运体抑制剂能够有效分离，各目标化合物在20μg/L-320μg/L范围内相关系数在0.9962-0.9997之间，线性良好，而且摄取和双向转运实验回收率分别在82.5％-91.0％与93.2％-97.80％之间，日间相对变异系数均≤10％。
　　3、细胞摄取试验:首先考察了不同药物孵育时间(5min、10min、15min和20min)对IPEC-J2细胞、BRL细胞和PK15细胞摄取32μmol/L四种目标化合物的影响，结果表明第10min时的细胞摄取量最大，从而确定最佳摄取时间为10min;然后考察了不同药物孵育浓度(8μmol/L、16μmol/L和32μmol/L)对细胞摄取的影响，结果表明随着添加浓度的增加，细胞摄取量呈线性增加趋势，因此确定最大添加浓度为32μmol/L。接着在此基础上进行特异性抑制试验。特异性抑制试验是通过向细胞中添加转运体抑制剂后与对照组相比，细胞对喹赛多及其主要代谢物摄取量的变化。结果显示在IPEC-J2细胞摄取试验模型中，OATP抑制剂利福平减少了Cy2和Cy10的细胞摄取量，MRP抑制剂环孢素增加了Cy0的细胞摄取，P-gp抑制剂维拉帕米增加了Cy0和Cy1的细胞摄取。在BRL细胞摄取试验模型中，利福平同样减少了Cy2和Cy10的细胞摄取，维拉帕米增加了Cy0和Cy1的细胞摄取。对于PK15细胞摄取试验模型，OAT抑制剂丙磺舒减少了Cy1的细胞摄取，环孢素增加Cy0的细胞摄取，而且维拉帕米同时增加了Cy0的Cy1的细胞摄取。统计分析表明具有显著性差异(P＜0.05)，而且表现出浓度依赖性，随着抑制剂浓度的增加，这种抑制作用越明显。根据结果推测Cy0是P-gp和MRP的共同底物，Cy1是P-gp和OAT的共同底物，Cy2和Cy10共同作为OATP的底物。
　　4、细胞单层双向转运试验:取生长良好的三种贴壁细胞制备成单个细胞悬液，按照一定的密度(IPEC-J2为3.5×105/mL，BRL和PK15为2×105/mL)接种在Transwell12孔板中，放在37℃、5％CO2培养箱中培养，每天换液。使用紫外分光光度计根据不同时间测定的苯酚红通透量，计算出表观渗透系数Papp(cm/sec)，结果显示当IPEC-J2细胞培养到第6天，BRL细胞与PK15细胞培养到第4天时苯酚红的表观渗透系数均小于10-6 cm/sec，说明细胞单层膜完整性良好，满足双向转运试验的要求。
　　然后在Transwell小室的顶侧(A，Apical)和基底侧(B，Basolateral)分别添加32μmol/L四种目标化合物以及128μmol/L五种转运体抑制剂，分别考察转运体抑制剂在不同时间(30min、60min和90min)对目标化合物细胞单层双向跨膜转运的影响。统计分析显示在IPEC-J2细胞单层模型中，OATP抑制剂利福平减少Cy2和Cy10的双向转运，在30min、60min和90min时，利福平组与对照组比较差异逐渐减小，具有时间依赖性;MRP抑制剂环孢素增加Cy0的双向转运，在BL→AP侧跨膜转运过程中表现出时间依赖性;P-gp抑制剂维拉帕米显著增加Cy0和Cy1的双向转运。在BRL细胞单层模型中，利福平显著减少Cy2和Cy10在AP→BL侧的跨膜转运，维拉帕米增加Cy0和Cy1在BL→AP侧跨膜转运，表现出时间依赖性。在PK15细胞单层模型中OAT抑制剂丙磺舒减少Cy1在AP→BL侧的跨膜转运，环孢素增加Cy0的双向跨膜转运，而维拉帕米增加了Cy0和Cy1的双向跨膜转运。结果进一步验证了Cy0是P-gp和MRP的共同底物，Cy1是P-gp和OAT的共同底物，Cy2和Cy10共同作为OATP的底物。另外根据结果可以推测转运体在三种细胞单层模型中存在极性分布现象，其中IPEC-J2细胞单层顶侧和基底侧膜表面主要分布有P-gp、MRP和OATP转运体;BRL细胞单层顶侧膜表面主要分布有OATP转运体，而基底侧膜表面主要分布有P-gp转运体;PK15细胞单层顶侧和基底侧主要分布有MRP和P-gp转运体，而顶侧膜表面主要分布有OAT转运体。

目录

声明

摘要

缩略语录(Abbreviation)

1 前言

1．1 研究背景

1．2 肠、肝和肾脏转运体研究进展

1．2．1 肠道药物转运体

1．2．2 肝脏药物转运体

1．2．3 肾脏药物转运体

1．2．4 主要药物转运体研究进展

1．3 药物转运体研究法进展

1．3．1 膜实验模型

1．3．2 细胞模型

1．3．3 原位／离体器官灌注模型

1．3．4 基因敲除小鼠或自然突变动物模型

1．3．5 化学敲除模型

1．4 细胞模型在药物转运体研究中的应用

1．4．1 常用的细胞系

1．4．2 试验类型

1．5 目的与意义

1．5．1 研究思路

1．5．2 研究内容

1．5．3 研究目的与意义

2 材料与方法

2．1 细胞株

2．2 药品和试剂

2．3 主要仪器和设备

2．4 溶液配制

2．5 细胞的复苏、传代与冻存

2．6 MTT法检测喹赛多及其代谢物对细胞活力的影响

2．7 喹赛多及其主要代谢物在细胞摄取试验中的检测方法

2．7．1 HPLC色谱条件

2．7．2 样品处理

2．7．3 专属性

2．7．4 工作曲线

2．7．5 标准曲线

2．7．6 准确度与精密度

2．8 细胞摄取与时间的关系

2．9 细胞摄取与药物浓度的关系

2．10 转运体抑制剂对细胞摄取的影响

2．11 细胞单层双向转运模型的建立

2．11．1 Transwell小室中细胞单层的建立

2．11．2 Transwell小室中细胞完整性考察

2．12 喹赛多及其主要代谢物在细胞双向转运试验中的检测方法

2．12．1 HPLC条件

2．12．2 样品处理方法

2．12．3 专属性

2．12．4 工作曲线

2．12．5 标准曲线

2．12．6 准确度与精密度

2．13 跨膜转运试验

2．13．1 单层细胞膜AP至BL侧跨膜转运试验

2．13．2 单层细胞膜BL至AP侧跨膜转运试验

2．14 统计学分析

3 结果

3．1 细胞培养

3．2 喹赛多及其主要代谢物对细胞的活力影响

3．2．1 对IPEC-J2细胞细胞活力影响

3．2．2 对BRL细胞细胞活力影响

3．2．3 对PKl5细胞细胞活力影响

3．3 喹赛多及其主要代谢物HPLC检测方法的建立

3．3．1 专属性

3．3．2 工作曲线

3．3．3 标准曲线

3．3．4 准确度与精密度

3．3．5 BCA工作曲线

3．3．6 时间对细胞摄取效率的影响

3．3．7 浓度对细胞摄取效率的影响

3．3．8 特异性抑制剂对细胞摄取摄取效率的影响

3．4 细胞单层双向转运模型的建立

3．4．1 膜通透性

3．4．2 双向转运HPLC检测方法的建立

3．5 细胞单层双向转运试验

3．5．1 IPEC-J2细胞单层双向转运

3．5．2 BRL细胞单层双向转运

3．5．3 PK15细胞单层双向转运

4 讨论

4．1 毒性判断指标和指标研究方法的选择

4．2 细胞、药物、作用时间和剂量的选择

4．3 转运体及其抑制剂的选择

4．4 喹赛多及其代谢物定量方法学

4．5 细胞摄取效率与时间和浓度的关系

4．6 细胞单层双向转运模型的建立与评价方法

4．7 喹赛多及代谢物与转运体的关系

5 全文总结

文献综述 药物转运体研究概况

参考文献

致谢

研究生简介

附录