PGRP-LB和PGRP-SB基因在橘小实蝇免疫及肠道微生物调控中的作用研究

摘要

橘小实蝇Bactrocera dorsalis(Hendel)是一种重要的农业害虫，主要以幼虫潜食为害。橘小实蝇的寄主十分广泛，可危害柑桔、瓜类等多种水果、蔬菜和花卉。肠道微生物与昆虫本身密切相关，影响着宿主很多生理功能，如营养代谢、免疫等方面。本研究采用RT-PCR和RACE技术克隆获得基因PGRP-LB和PGRP-SB的ORF框序列，并通过注射和喂食大肠杆菌Escherichia coli研究橘小实蝇上述基因对条件致病菌的免疫响应;通过RNA干扰技术沉默基因PGRP-LB和PGRP-S，分析橘小实蝇的免疫响应及肠道微生物群落的变化，阐述这些基因在橘小实蝇免疫和肠道微生物稳态维持中的作用，以期为橘小实蝇的综合防治提供一种全新的防控思路和作用靶标。
　　1 PGRP-LB和PGRP-SB基因的克隆与表达模式
　　从NCBI获得橘小实蝇PGRP-LB基因ORF框的核苷酸序列长度为738bp，成功克隆到橘小实蝇PGRP-S基因ORF框的核苷酸序列，其长度为558bp。序列分析表明两个基因均与地中海实蝇相应基因序列的同源性最高，分别为86％和91％。表达模式结果表明PGRP-LB基因在橘小实蝇成虫中肠中表达量最高，其次在成虫脂肪体中表达量也较高，PGRP-SB基因主要在三龄幼虫和性成熟成虫脂肪体中表达。
　　2 PGRP-LB和PGRP-SB基因对条件致病菌感染的免疫响应
　　通过对橘小实蝇注射或喂食感染条件致病菌E.coli后，Imd信号通路中的抗菌肽基因Diptericin的表达量显著增加，注射E.coli后6h反应最强烈，Diptericin的表达量上调了6.40倍，喂食E.coli后12h反应最强烈，Diptericin的表达量上调了4.52倍;同时PGRP-LB和PGRP-SB基因表达水平明显上调，注射菌液后6h PGRP-LB基因表达量上调2.97倍，注射菌液后24h PGRP-SB基因表达量上调1.61倍;喂食菌液后12h PGRP-LB和PGRP-S基因反应均最强烈，表达量分别比对照组上调了54.32％和30.26％。但注射感染比喂食感染引起的体液免疫反应更为强烈迅速。这些结果表明E.coli能启动橘小实蝇系统及肠道Imd信号通路的免疫反应，且抗菌肽基因Diptericin与PGRP-LB和PGRP-SB基因在免疫防御过程中起着重要作用。
　　3 PGRP-LB和PGRP-SB基因对橘小实蝇免疫反应的影响
　　通过干扰PGRP-LB和PGRP-SB基因后注射或喂食E.coli研究PGRP-LB和PGRP-SB基因在橘小实蝇免疫中的作用。研究发现，沉默PGRP-LB和PGRP-SB基因的橘小实蝇在注射或喂食感染E.coli后，其抗菌肽基因Diptericin的表达量与对照组相比均显著上调，免疫反应增强且免疫反应持续时间增长。以上结果说明PGRP-LB和PGRP-SB基因能抑制橘小实蝇肠道免疫系统过激的免疫反应，起到免疫负调控作用。
　　4 PGRP-LB和PGRP-SB基因沉默对橘小实蝇肠道微生物群落的影响
　　通过PGRP-LB和PGRP-SB基因的RNAi，研究PGRP-LB和PGRP-SB基因在橘小实蝇肠道内共生菌群落稳态维持中的作用。Real-time PCR结果表明，干扰后5天内PGRP-LB和PGRP-S基因表达量都处于下调状态，第15天时基因表达量恢复正常，与对照组表达量无显著差异。同时分别于第5、15、20天检测肠道微生物群落变化，结果表明PGRP-LB基因干扰后第5天肠道内总细菌数量、γ-变形菌门(γ-Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)细菌分别下调18.78％、56.67％、61.98％和67.46％;PGRP-SB基因干扰后第5天肠道内总细菌数量、α-变形菌门(α-Proteobacteria)、γ-变形菌门(γ-Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)分别下调31.73％、40.41％、44.64％、50.26％、52.19％和70.18％。PGRP-LB基因干扰后第15天肠道内总细菌数量、α-变形菌门(α-Proteobacteria)、γ-变形菌门(γ-Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)细菌分别上调2.16倍、1.04倍、1.65倍、0.38倍、2.70倍、0.84倍。PGRP-SB基因干扰后第15天肠道内总细菌数量和放线菌门(Actinobacteria)细菌无显著变化，α-变形菌门(α-Proteobacteria)、γ-变形菌门(γ-Proteobacteria)细菌分别上调53.77％和60.48％，拟杆菌门(Bacteroidetes)和厚壁菌门（Firmicutes）细菌分别下调14.89％和63.60％。PGRP-LB基因干扰后第20天肠道内总的细菌和五个门的细菌数量均恢复到正常水平。PGRP-SB基因干扰后第20天肠道内总的细菌和γ-变形菌门(γ-Proteobacteria)细菌分别下调45.96％和62.06％，其他四个门的细菌数量没有显著变化。
　　这些结果表明PGRP-LB和PGRP-SB基因的缺失确实能够引起橘小实蝇肠道微生物群落的改变，PGRP-LB和PGRP-SB基因在肠道微生物群落稳态维持中起着不可或缺的作用。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1 橘小实蝇概述

2 昆虫免疫

2．1 昆虫细胞免疫

2．2 昆虫体液免疫

2．3 昆虫肠道免疫

3 肽聚糖识别蛋白

4 昆虫肠道微生物

4．1 肠道微生物对昆虫的作用

4．2 实蝇肠道微生物研究

4．3 肠道微生物调控策略

5 本研究的目的意义及创新点

5．1 本研究的目的意义

5．2 本研究的创新点

6 技术路线

第二章 基因克隆及表达模式检测

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 实验方法

2 结果与分析

2．1 橘小实蝇总RNA提取

2．2 RT-PCR扩增相关基因片段

2．3 PCR产物的克隆与测序

2．4 荧光引物扩增效率确认

2．5 目的基因的筛选

2．6 表达模式检测

3 小结

第三章 PGRP-LB和PGRP-SB基因的免疫功能与RNAi效应研究

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 实验方法

2 结果与分析

2．1 目标基因dsRNA检测

2．2 病原菌液注射感染对橘小实蝇系统免疫的影响

2．3 病原菌液喂食感染对橘小实蝇肠道免疫的影响

2．4 PGRP-LB和PGRP-SB基因的dsRNA干扰效果

2．5 PGRP-LB和PGRP-SB干扰后菌液注射感染处理

2．6 PGRP-LB和PGRP-SB干扰后菌液喂食感染处理

2．7 肠道菌群变化

3 讨论

结论与展望

参考文献

作者在攻读硕士研究生期间发表论文

致谢