猪轮状病毒VP3蛋白C端结构域的结构学研究

摘要

轮状病毒(Rotavirus, RV)是重要的人畜共患病原之一，腹泻和呕吐为其主要引起的典型临床症状。轮状病毒的存在，不仅严重影响畜牧业的发展，同时也威胁到人类的安全，引起严重经济损失，成为科学研究的焦点。本研究将以猪轮状病毒(Procine Rotavirus，PRV)结构蛋白VP3的C端结构域（VP3-CTD）作为主要研究对象，通过结构生物学方法分析其在病毒致病性和免疫逃逸方面的作用。研究表明人源VP3-CTD对RV的致病性有重要影响。同时，该区域还具有2'，5'-磷酸二酯酶(2'-5'PDEs)的活性，可以通过切割由2'，5'-寡腺苷酸合成酶(2'，5'-oligoadenylatesynthetase，OAS)合成的2'，5'-寡腺苷酸(2'-5'A)来抑制OAS-RNase L信号通路，使病毒逃逸宿主的先天性免疫致使机体发病。因此，通过研究PRV VP3-CTD的结构，可以进一步了解PRV的致病和免疫逃逸的机制，为抗PRV的药物的筛选奠定基础。
　　本研究首先对猪轮状病毒VP3-CTD基因密码子进行优化，并将VP3-CTD基因克隆到原核表达载体pET30a上进行原核表达纯化;在原核表达过程中对含有重组载体的Rosseta(DE3)表达条件进行优化，结果表明在0.5mmol/LIPTG、18℃、180rpm/min、18h的条件下目的蛋白的可溶性良好，获得了可溶性较高的蛋白;将表达的蛋白利用Ni2+柱亲和层析和分子筛层析进行纯化，并通过超滤法得到了高浓度、高纯度、非单体形式的VP3-CTD蛋白进行后续的蛋白结晶实验的蛋白结晶实验。
　　在蛋白结晶条件筛选方面，本研究采用坐滴法进行筛选。通过多种条件的筛选，我们发现在HR2-110试剂盒的36号条件下(0.1mo/L Tris-HCl pH8.5，8％ PEG8000)蛋白结晶状况较好，最终通过进一步的优化得到晶体生长的最佳条件为0.15mol/LTris-HCl pH8.3、4％ PEG8000、8％ EG、60days、20℃;在该条件下蛋白可以结晶成X射线衍射较强的规则长方体晶体，其晶体大小为15μm×15μm×200μm，通过X射线衍射实验得到晶体的分辨率为2.3(A)，并收取数据。利用分子置换法和多种晶体分析软件进行数据分析，解析出VP3-CTD的蛋白晶体结构。通过分析表明VP3-CTD是以同源二聚体的形式存在，其单体结构主要有2个α螺旋和7个β折叠组成，C端的β折叠形成一个凹槽，该蛋白的表面静电势显示，凹槽主要带正电荷，二聚体是两分子VP3-CTD蛋白的凹槽互补嵌合的结构，中间形成一个带较强正电荷的间隙，推测其为结合和切割带负电荷的2'-5'A的区域。
　　总之，本研究通过表达和纯化PRV的VP3-CTD蛋白，并对其进行晶体结构的解析，进一步揭示了其切割2'-5'A的结构基础，为抗PRV药物的筛选提供理论依据。

目录

声明

摘要

缩略语表(Abbreviation)

1 文章综述

1．1 猪轮状病毒概述

1．1．1 猪轮状病毒流行病学

1．1．2 猪轮状病毒形态结构

1．1．3 猪轮状病毒理化特性

1．1．4 猪轮状病毒基因组成和所编码的蛋白

1．1．5 猪轮状病毒结构蛋白的功能

1．1．6 猪轮状病毒非结构蛋白的功能

1．1．7 猪轮状病毒与免疫相关的结构蛋白

1．2 OAS-RNase L系统在抗病毒中的研究进展

1．2．1 2'-5’寡聚腺苷酸合成酶(2’-5’oligoadenylate synthetase，OAS)

1．2．2 2’-5’寡聚腺苷酸(2’-5’A)

1．2．3 核糖核酸酶(RNasc L)

1．2．4 OAS-RNase L信号通路的抗病毒机制

1．2．5 VP3．CTD蛋白抑制OAS．RNase L信号通路的研究

1．3 蛋白质结晶学研究

1．3．1 蛋白质结晶的方法与原理

1．3．2 结晶生长条件的优化

1．3．3 蛋白质晶体数据的收集

1．3．4 晶体结构解析和精修

1．4 研究目的及意义

2 材料与方法

2．1 材料

2．1．1 质粒

2．1．2 菌株

2．1．3 实验仪器和材料

2．1．4 主要酶与试剂盒

2．1．5 主要培养基及相关配制

2．1．6 主要试剂及相关配制

2．1．7 主要缓冲液及相关配制

2．1．8 主要分析软件

2．1．9 引物

2．2 实验方法

2．2．1 基因克隆、原核表达载体的构建

2．2．2 VP3-CTD蛋白在大肠杆菌中表达与纯化

2．2．3 VP3-CTD蛋白质结晶及结晶条件的筛选和优化

2．2．4 VP3-CTD蛋白晶体衍射数据采集与结构解析

3 结果与分析

3．1 VP3-CTD表达载体的构建

3．1．1 VP3-CTD基因的扩增

3．1．2 重组质粒的酶切鉴定

3．2 VP3-CTD蛋白在大肠杆菌中表达与纯化

3．2．1 VP3-CTD基因在大肠杆菌中的诱导表达与鉴定

3．2．2 VP3-CTD蛋白原核表达条件的确定

3．2．3 VP3-CTD蛋白的纯化

3．3 VP3-CTD蛋白质结晶及结晶条件的筛选和优化

3．3．1 VP3-CTD蛋白结晶条件的筛选

3．3．2 VP3-CTD蛋白结晶的鉴定

3．3．3 VP3-CTD蛋白结晶的优化

3．4 VP3-CTD蛋白晶体衍射数据收集与结构解析

3．4．1 VP3-CTD蛋白结晶的衍射数据收集及修正

3．4．2 VP3-CTD蛋白结构解析

4 讨论

4．1 VP3-CTD蛋白的表达和纯化

4．2 VP3-CTD蛋白的纯化

4．3 VP3-CTD蛋白晶体的结构解析

5．结论

参考文献

致谢