磷酸化Osteopontin抑制磷酸钙和草酸钙结晶的动力学研究

摘要

为了更好的理解植物体内草酸钙的生物矿化过程，本文借助模拟人体病理矿物（如肾结石）的形成，研究多肽分子对其形成的影响，从而比较植物与动物体内生物矿化作用的差异，为探明植物中草酸钙类晶体的生物矿化机理提供理论依据。人体肾结石中，含钙结石是最普遍的形式，约80％的肾结石由草酸钙和磷酸钙组成。尿液中的Osteopontin(OPN)蛋白可抑制草酸钙和磷酸钙的结晶。然而，对于OPN蛋白磷酸化程度和抑制效果之间关系，及OPN蛋白在纳米尺度调控矿物晶面台阶生长和溶解动力学机制的相关研究较少。本研究主要借助原位原子力显微镜，结合其他体相结晶技术及蛋白分析和表征手段，定量分析磷酸钙和草酸钙的成核及台阶生长和溶解动力学，得到的主要结果如下:
　　1.OPN多肽羟基磷灰石(HAP)结晶的抑制与多肽磷酸化程度及浓度紧密相关
　　在近生理条件下（pH7.40，离子强度I=0.15 mol/L），借助电位监控的方法，研究含有14个氨基酸残基的OPN多肽(14-mer OPN)对HAP成核和生长的影响。结果发现，随着OPN多肽（156 nmol/L）磷酸化程度的增加，HAP成核所需的诱导时间显著延长。相同序列的非磷酸化OPN只在其浓度较高（234 nmol/L）时，才能通过延长诱导时间有效抑制HAP的成核。在一定浓度范围内（＜156 nmol/L），磷酸化修饰的OPN不仅提高了成核期磷酸钙纳米颗粒的稳定性，同时还抑制了纳米颗粒从无定形相向晶相的转变。这些表明，OPN多肽以磷酸化程度和浓度双重调控方式抑制HAP的结晶。
　　2.磷酸化OPN多肽对二水磷酸氢钙(DCPD)(010)面台阶生长动力学和界面能的双重控制
　　借助原子力显微镜，原位探测磷酸化OPN多肽与DCPD(010)面的相互作用时发现，磷酸化OPN多肽专一地吸附[(1)00]Cc方向台阶，从而抑制台阶的移动。经典的晶体生长Cabrera-Vermilyea物理模型可很好地解释在不同过饱和度下，磷酸化OPN多肽对台阶移动的抑制作用。此外，磷酸化OPN多肽侧链上的磷酸根通过静电作用，吸附在[(1)00]Cc台阶改变矿物-水界面能，从而延迟晶面生长过程中台阶的形成。非磷酸化的OPN多肽完全不具备抑制效果。晶面生长动力学结果和体相成核结果一致。进一步证实了磷酸化OPN多肽对台阶动力学和界面能的双重控制作用。
　　3.磷酸化OPN多肽显著抑制草酸钙的异质成核和团聚
　　在模拟的酸性尿液生理条件下，借助原子力显微镜，原位观察尿液的两种组分草酸和OPN多肽对DCPD(010)面[101]Cc，[(1)00]Cc和[10(1)]Cc三个方向台阶溶解的影响。结果表明磷酸化OPN多肽专一性地抑制[101]Cc方向台阶的移动，进而减少钙离子的释放，并显著抑制DCPD表面诱导—水合草酸钙的成核。这不但体现了矿物溶解再结晶的过程，同时还展示了天然蛋白对此过程的调控作用，更加深了我们对结石形成抑制机制的理解。
　　本文结合晶面动力学和体相结晶动力学的方法，着重探讨了多肽分子与矿物表面的相互作用。此研究不但揭示了磷酸钙-草酸钙病理矿化的动力学过程，同时还为理解香蕉体内生物矿化机制提供有效线索。

目录

声明

摘要

缩略语表

图目录

表目录

1 文献综述

1．1．生物矿化概述

1．2．人体中的生物矿化

1．2．1．概述

1．2．2．肾结石概述

1．2．3．草酸钙结石

1．2．4．磷酸钙结石

1．3．磷酸钙晶体的体相成核

1．3．1．热力学过程

1．3．2．成核

1．3．3．成核动力学

1．4．磷酸钙晶体的生长

1．4．1．生长方式

1．4．2．生长动力学

1．4．3．添加分子对晶体生长的调控

1．5．磷酸钙晶体的溶解

1．6．OPN蛋白

1．6．1．分布

1．6．2．结构和生物学作用

1．6．3．生物矿化过程中的作用

2 课题研究的背景、内容和技术路线

2．1．课题研究的背景和意义

2．2．研究内容

2．3．技术路线

3 OPN多肽对羟基磷灰石(HAP)体相成核过程的影响

3．1．前言

3．2．材料与方法

3．2．1．实验材料

3．2．2．实验方法

3．3．结果与分析

3．3．1．HAP晶体的体相成核

3．3．2．Ca-P-OPN纳米颗粒的粒径分布

3．3．3．Ca-P-OPN纳米颗粒的形貌

3．3．4．Ca-P-OPN纳米颗粒的晶相

3．4．讨论

3．4．1．OPN多肽对HAP成核的影响

3．4．2．OPN多肽对HAP结晶的抑制机制

3．5．结论

4 磷酸化OPN多肽对DCPD晶面生长动力学过程的影响

4．1．前言

4．2．材料与方法

4．2．1．实验材料

4．2．2．实验方法

4．3．结果与分析

4．3．1．AFM原位观测DCPD晶体的生长

4．3．2．DCPD晶体的体相成核

4．4．讨论

4．4．1．3P-OPN对DCPD晶体生长动力学过程的影响

4．4．2．3P-OPN抑制DCPD体相成核的机制

4．5．结论

5．磷酸化OPN多肽对DCPD晶面溶解动力学及其表面COM异质成核过程的影响

5．1．前言

5．2．材料与方法

5．2．1．实验材料

5．2．2．实验方法

5．3．结果与分析

5．3．1．AFM原位观测DCPD的溶解

5．3．2．DCPD(010)面草酸钙的成核和生长

5．3．3．3P-OPN多肽对蚀坑形貌的修饰

5．4．讨论

5．4．1．DCPD-草酸固液界面的溶解动力学

5．4．2．DCPD-草酸固液界面溶解和结晶反应的机制

5．5．结论

6．全文总结与展望

6．1．主要结论

6．2．创新点

6．3．展望

参考文献

个人简介

常用仪器型号及品牌

致谢