副猪嗜血杆菌喹诺酮耐药分子特征及猪链球菌多重耐药机制研究

摘要

细菌耐药性是细菌抵抗药物杀伤或抑制作用的一种表型，是制约临床细菌疾病预防和治疗的一个重要因素。随着抗菌药物的研究与发展，其临床应用也越来越广泛，甚至一些滥用现象也开始频繁出现，这都为细菌耐药性的出现提供了有利条件。近年来，细菌的耐药性问题越来越严峻(Aarestrup2005)，细菌的耐药性正在朝着高耐药率，多重耐药的方向发展，已经成为了一个严重的人类公共卫生问题。副猪嗜血杆菌(HPS)和猪链球菌(SS)作为全球性的重要的猪传染病病原，近年来随着养猪业的快速发展，其耐药情况也越来越严重，本论文对其耐药机制分别进行了研究，主要的成果如下:
　　1、副猪嗜血杆菌临床分离菌株喹诺酮耐药分子机制研究
　　本研究中，以138株HPS临床分离菌株为研究对象，首先利用E-test药敏纸条分别检测每株细菌对恩诺沙星和左旋氧氟沙星的MIC值，根据2008年颁布的CLSI标准，判定138株HPS的耐药情况分别为:恩诺沙星的耐药率为60.1％，左旋氧氟沙星的耐药率为5.8％，并且左旋氧氟沙星的耐药菌株对恩诺沙星均表现出了高水平的耐药性。进一步，通过测序分析喹诺酮耐药相关基因DNA解旋酶(GyrA、GyrB)和拓扑异构酶Ⅳ(ParC、ParE)的突变情况，结合各菌株的耐药性，共发现了10个耐药相关基因突变位点。其中，GyrA87位点在所有恩诺沙星耐药菌株中的突变率为100％，提示了GyrA87位点的突变对HPS喹诺酮耐药性形成的重要性;进一步分析发现ParC73位点的突变，能够协助其它相关突变位点增强HPS对喹诺酮药物的耐受性;甚至，本研究中还首次发现了ParE的耐药相关突变位点（ParE551位点的突变）。为了更加直接的证明DNA解旋酶和拓扑异构酶Ⅳ的突变是引起HPS耐受恩诺沙星和左旋氧氟沙星的原因，本研究中，进行了定向点突变实验，分别为:GyrA(87D→N)、 ParC(73S→R)、ParE(551T→A)，结果发现这3个位点的突变均能使细菌对恩诺沙星和左旋氧氟沙星的MIC值明显升高，证明了DNA解旋酶和拓扑异构酶Ⅳ的突变确实是引起细菌耐受喹诺酮的重要原因。另外，本研究中继续分析了HPS的假设毒力因子与其喹诺酮耐药性之间的相关性，结果发现HPS的喹诺酮耐药菌株较其敏感菌株，含有更多的假设毒力因子（hh dA、fimB和hsdR），表明在HPS中，喹诺酮耐药性与其假设毒力因子之间存在正相关性，这一结果不同于以往的任何相关报道，这为该方面的研究提供了新的视野，使其更加全面和丰富。
　　2、猪链球菌R61多重耐药机制的研究
　　R61是本实验室前期工作中发现的一株“超级耐药”猪链球菌，虽然通过比较基因组学分析部分解释了其耐药机制，但是却并不完善，因此，本研究以R61为研究对象，继续对其多重耐药机制展开了研究。首先，将R61在不同条件下培养（分别添加阿莫西林、氯霉素、头孢噻肟、红霉素、左氧氟沙星、四环素，无抗生素添加，以及同时添加上述6种抗生素），待其生长至对数中期时，分别提取其全菌蛋白。然后进一步通过双向电泳分析药物刺激后R61的差异表达蛋白，共46个（大于2倍），其中上调表达蛋白32个，下调表达蛋白14个，并分别对这些差异蛋白进行质谱鉴定。为了进一步探索R61的耐药机制，结合各蛋白的功能及特点，选取可能与耐药性相关的13个蛋白（上调9个，下调4个），分别构建其过表达菌株（上调蛋白构建A7过表达菌株，下调蛋白构建R61过表达菌株）并检测其MIC值的变化情况，结果发现:SSUR61_0413（β-内酰胺水解酶）和SSUR61_2137（新陈代谢控制蛋白A）基因的上调，以及SSUR61_1509（自溶素）的下调，均能够使细菌对药物的MIC值明显变化。另外，SSUR61_0927（甲基转移酶）基因的上调也能够使A7对红霉素的耐药性明显提升。最终我们发现，R61能够通过诱导β-内酰胺酶产生、增强新陈代谢以及降低自溶素溶解，进而促进其多重耐药性。

目录

论文说明

声明

摘要

缩略词表

第1章 文献综述

1．1 前言

1．2 细菌耐药机制的研究进展

1．2．1 β-内酰胺类

1．2．2 大环内酯类

1．2．3 氨基糖苷类

1．2．4 喹诺酮类

1．2．5 其它种类抗菌药物

1．2．6 多重耐药机制

1．3 细菌耐药性检测

1．3．1 细菌耐药性评判标准

1．3．2 细菌耐药性检测方法

1．4 细菌耐药性的预防策略

1．4．1 合理使用抗菌药物

1．4．2 预防耐药菌的传播

1．4．3 加强细菌耐药性的监测和管理

1．5 副猪嗜血杆菌及其耐药性研究

1．5．1 副猪嗜血杆菌病及其流行病学

1．5．2 副猪嗜血杆菌假设毒力相关因子

1．5．3 副猪嗜血杆菌耐药性研究

1．6 猪链球菌耐药性研究

1．6．1 猪链球菌病及其流行病学

1．6．2 猪链球菌耐药性研究

1．7 研究内容

第2章 副猪嗜血杆菌临床分离菌株喹诺酮耐药分子机制研究

2．1 前言

2．2 材料

2．2．1 主要仪器

2．2．2 主要试剂

2．2．3 培养基及缓冲液

2．3 方法

2．3．1 细菌培养

2．3．2 E-test药敏纸条检测副猪嗜血杆菌恩诺沙星和左旋氧氟沙星MIC值

2．3．3 副猪嗜血杆菌基因组提取

2．3．4 引物设计与合成

2．3．5 目的基因的PCR扩增

2．3．6 PCR产物的电泳和回收

2．3．7 pET-28a(+)质粒的提取

2．3．8 DNA片段和载体的酶切

2．3．9 DNA片段和载体的连接

2．3．10 连接产物的转化

2．3．11 重构的质粒提取和鉴定

2．3．12 质粒的点突变

2．3．13 检测含有定向点突变基因菌株的MIC值

2．3．14 副猪嗜血杆菌假设毒力相关因子的PCR扩增

2．4 结果与分析

2．4．1 138株副猪嗜血杆菌的地域分布与血清型

2．4．2 副猪嗜血杆菌对恩诺沙星和左旋氧氟沙星的耐药性检测与分析

2．4．3 DNA促旋酶和拓扑异构酶Ⅳ在副猪嗜血杆菌不同菌株间的同源性分析

2．4．4 分别对138株HPS菌株的GyrA、GyrB、ParC和PraE进行PCR扩增并测序分析

2．4．5 138株副猪嗜血杆菌喹诺酮耐药相关基因突变位点的鉴定与分析

2．4．6 耐药相关突变位点在影响菌株MIC值时的协同作用

2．4．7 GyrA、ParC和PraE定向点突变质粒构建

2．4．8 副猪嗜血杆菌与大肠杆菌的GyrA、ParC和PraE的同源比对分析

2．4．9 GyrA、ParC和PraE定向点突变对细菌耐药性的影响

2．4．10 副猪嗜血杆菌假设毒力基因的PCR扩增及鉴定

2．4．11 副猪嗜血杆菌喹诺酮耐药性与其假设毒力因子相关性的分析

2．5 小结

2．6 讨论

第3章 猪链球菌R61多重耐药机制研究

3．1 前言

3．2 材料

3．2．1 主要仪器

3．2．2 主要试剂

3．2．3 培养基及缓冲液

3．3 方法

3．3．1 菌株及质粒

3．3．2 猪链球菌基因组提取

3．3．3 猪链球菌R61全蛋白提取

3．3．4 双向电泳

3．3．5 染色

3．3．6 图像扫面及分析

3．3．7 酶解及MALDI-TOF-MS鉴定

3．3．8 生物信息学检索

3．3．9 pSET-2载体的提取

3．3．10 融合PCR

3．3．11 重组质粒的电转化

3．3．12 突变菌株MIC值的检测

3．4 结果与分析

3．4．1 R61菌株不同培养条件下的生长曲线分析

3．4．2 双向电泳分析8种条件下R61的差异表达蛋白

3．4．3 构建差异蛋白的重组菌株并检测其MIC值

3．5 小结

3．6 讨论

第4章 结论

参考文献

附件

致谢

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