副猪嗜血杆菌耐药性调查及其对氟苯尼考耐药分子特征研究

摘要

副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis,HPS）属于革兰氏阴性菌，主要引起猪多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎，又称格拉瑟病（Glasser's disease）。目前，该病呈世界性分布，并对全球养猪业造成巨大的经济损失。到目前为止，副猪嗜血杆菌共有15种血清型。该病虽然可以通过疫苗进行预防，但是由于相当数量的临床分离株不能血清分型，并且疫苗的交叉保护能力差。所以药物治疗仍然是控制该病最为有效的方式。然而，随着养猪业的快速发展，抗生素的不规范使用越来越普遍，细菌的耐药情况也越来越严重。本文对华南和华北地区分离的副猪嗜血杆菌进行了耐药表型的调查，对氟苯尼考抗性菌株血清型进行了鉴定，进行了PFGE分型，并对氟苯尼考耐药分子特征进行了探究。旨在阐明氟苯尼考耐药基因流行特征及其分子机制，以期对该病原菌耐药性的风险评估及防控提供一定的科学依据。　　本研究用微量琼脂稀释法检测了2012-2016年间华南和华北地区106株副猪嗜血杆菌临床分离株20种药物的敏感性。结果表明106株副猪嗜血杆菌对喹诺酮类药物左氧氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星的耐药率为2.83%－22.64%；有1.89%－16.03%的菌株对β-内酞胺类药物青霉素、氨苄西林、头孢噻呋等耐药；菌株对四环素和多西环素耐药分别为27.32%和16.52%；对萘啶酸，磺胺甲恶唑和TMP的耐药率高达96.23%，对庆大霉素和红霉素耐药率分别为40.87%和46.96%；另外还有17.92%的菌株对氯霉素耐药，7.54%的菌株对氟苯尼考耐药。从 106 株副猪嗜血杆菌的多重耐药（包括耐不同种类的药物，以及耐同类药物中的不同药物）研究，可以看出被检测菌株主要以7重（19.13%）、8重（17.39%）耐药为主，其次是9重（12.17%）、5重（9.57%）和6重（9.57%）耐药。　　耐药性敏感实验发现8株呈现氟苯尼考耐药的副猪嗜血杆菌，通过对氟苯尼考耐药的副猪嗜血杆菌菌株进行PFGE分型，结果显示华北地区副猪嗜血杆菌氟苯尼考耐药株PFGE指纹图谱完全相同，均呈现相同的条带，属于同一PFGE分型；利用琼脂扩散实验鉴定8株氟苯尼考耐药的副猪嗜血杆菌血清型，结果8株菌均为2型。上述结果说明华北地区的猪场间的氟苯尼考耐药菌株长时间存在克隆传播的关系。　　检测8株菌株氟苯尼考耐药相关基因floR、fexA 、fexB和cfr，结果8株菌均为floR阳性；扩增8株氟苯尼考抗性菌floR基因，产物回收连接到载体转化后测序得获得floR基因序列，再将序列翻译为氨基酸序进行比对，结果显示：8株菌floR基因氨基酸序列有高达99.8%-100%的相似度；通过 GPS-PCR 试验 、质粒提取以及大片段电泳发现，8株氟苯尼考耐药菌株中floR基因均定位于大小约为5 kb的质粒上，最后将质粒测序发现8株耐药菌中的携带floR的质粒序列相同，为同一质粒，将其命名为pHF。质粒的转化与药敏试验表明，pHF可以介导氟苯尼考耐药。注释该质粒结果显示，质粒pHF由3个开放阅读框组成，包括质粒复制相关基因rep、氟苯尼考耐药基因floR以及转录调控因子lysR。数据库搜索鉴定出与pHF序列同源性较高的3个质粒，包括质粒 pB1001（GenBank,登录号：EU252517），质粒 pCCK381（GenBank,登录号：AJ871969）和质粒pMh1405（GenBank,登录号：AB621552）。pHF质粒似乎与来自上述质粒的不同元件组装，这表明重组事件可能发生在这些小质粒之间并形成新的抗性质粒。

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