副猪嗜血杆菌耐药性调查及其对氟苯尼考耐药分子机制的研究

摘要

副猪嗜血杆菌是一种革兰氏阴性杆菌，易引起猪的多发性浆膜炎、脑膜炎、关节炎等疾病。副猪嗜血杆菌是条件致病菌，经常继发感染于一些病毒性疾病如猪伪狂犬病、猪流感、猪瘟，另外，还会与诸如猪繁殖与呼吸综合征、猪圆环病毒病等免疫抑制性疾病发生混合感染，极大损害了一线养殖业的经济效益。目前该病的防治主要依靠抗菌药治疗，但由于抗菌药长期盲目地使用，使得副猪嗜血杆菌对临床常用抗菌药产生不同程度的耐药，耐药菌株的盛行给该病的治疗带来了极大挑战。因此，临床上对其药物敏感性进行长期监控成为防治的关键，对其耐药机制进行研究也为控制耐药性的扩散提供理论支持。
　　本研究旨在调查我国上海地区副猪嗜血杆菌对临床常用抗菌药的耐药情况，为该病的临床用药与防治提供数据支持。试验共采集484个样品，分离鉴定出62株副猪嗜血杆菌。采用微量琼脂稀释法测定21种临床常用抗菌药的最小抑菌浓度。药物敏感性测定结果表明，所有菌株都对阿奇霉素、替米考星、泰妙菌素、阿米卡星、头孢噻呋和左氧氟沙星敏感，其中90％以上菌株对红霉素(60，96.8％)、氟苯尼考(59，95.3％)、氯霉素(60，96.8％)、庆大霉素(60，96.8％)、壮观霉素(61，98.4％)、青霉素(57，91.9％)、氨苄青霉素(57，91.9％)和环丙沙星(61，98.4％)敏感。对四环素和恩诺沙星耐药率较高，分别为75.8％和30.6％。耐药谱分析显示，主要耐药谱型有17种，9.7％的菌株对三种以上的抗菌药耐受，37.1％的菌株对两种以上的抗菌药耐受。最多同时耐5种药物，但耐药菌株比例较低(1，1.5％)。
　　本研究首次发现了3株呈现氟苯尼考耐药的副猪嗜血杆菌，对耐药菌株进行氟苯尼考耐药基因检测，发现三株菌均携带外排泵基因floR，其核苷酸序列全长为1215bp，与已报道的floR长度一致。其氨基酸序列与已经报道的大肠杆菌内氟苯尼考抗性基因floR(GenBank登录号:NC_012692)的氨基酸序列同源性高达97％。通过质粒提取、大片段电泳以及Southern Blot试验发现，三株氟苯尼考耐药菌株中floR基因均定位于大小约为6kb的质粒上，而并非基因组上。利用Primer Walking对上述质粒全序列进行测定，发现三株耐药菌中的携带floR的质粒大小和序列完全一致，为同一质粒，命名其为pHPSF1。生物信息学分析表明该质粒有5个开放阅读框，包括质粒转移及复制相关基因（mobA/L、mobC和rep）、氟苯尼考耐药基因floR以及转录调控因子lysR。序列比对及分析显示，质粒pHPSF1与多个来源于动物病原菌的耐药质粒同源性较高，提示这些质粒之间在抗菌药物的选择性压力下可发生重组并进化为新型的耐药质粒。本研究结果显示上海地区的副猪嗜血杆菌对临床常用抗菌药物耐药总体状况尚不严重，但鉴于多个临床常用药物（如氟苯尼考）的耐药菌株已经出现，应对其耐药性进行长期监测，对耐药菌株的分子传播机制进行深入研究，以便更有效地对耐药菌株的大规模流行进行防控，保障养殖业的经济效益。

目录

声明

摘要

英文缩略表

第一章 引言

1．1 副猪嗜血杆菌病的研究进展

1．1．1 副猪嗜血杆菌介绍

1．1．2 临床症状和病理变化

1．1．3 副猪嗜血杆菌病的诊断

1．1．4 副猪嗜血杆菌病的防治措施

1．2 细菌耐药性研究进展

1．2．1 细菌耐药性产生机理

1．2．2 多重耐药性机理

第二章 副猪嗜血杆菌的分离与鉴定

2．1 实验材料

2．1．1 样本来源

2．1．2 样本菌株

2．1．3 主要试剂与试剂盒

2．1．4 主要培养基及其配制

2．1．5 常用缓冲液及其他试剂的配制

2．1．6 主要仪器设备

2．2 实验方法

2．2．1 样本菌株的采集与分离

2．2．2 副猪嗜血杆菌的鉴定与保存

2．3 实验结果

2．3．1 副猪嗜血杆菌的形态特征

2．3．2 PCR鉴定与菌株测序

2．3．3 副猪嗜血杆菌的分离情况

2．4 讨论

2．4．1 副猪嗜血杆菌的分离情况

第三章 副猪嗜血杆菌的耐药性调查

3．1 实验材料

3．1．1 试验菌株

3．1．2 质控菌株

3．1．3 主要药品与试剂

3．1．4 主要培养基及其配制

3．1．5 常用抗生素标准品及工作母液配制

3．1．6 常用缓冲液及其他试剂的配制

3．1．7 主要仪器设备

3．2 实验方法

3．2．1 试验菌株与质控菌株的复壮

3．2．2 含药琼脂平板的制备

3．2．3 微量琼脂稀释法测试药物敏感性

3．2．4 结果判断

3．3 实验结果

3．3．1 副猪嗜血杆菌耐药性

3．3．2 多重耐药性与耐药谱

3．4 讨论

第四章 副猪嗜血杆菌对氟苯尼考耐药分子机制的研究

4．1 实验材料

4．1．1 试验菌株

4．1．2 主要试剂与试剂盒

4．1．3 主要培养基及其配制

4．1．4 常用缓冲液及其他试剂的配制

4．1．5 主要仪器设备

4．2 实验方法

4．2．1 氟苯尼考耐药基因floR的检测

4．2．2 氟苯尼考耐药基因floR的定位

4．2．3 质粒的酶切、测序、分析及注释

4．2．4 质粒的转化与鉴定

4．3 实验结果

4．3．1 耐药基因floR的鉴定结果与序列分析

4．3．2 携带floR基因副猪嗜血杆菌的基因定位

4．3．3 质粒的酶切与测序

4．3．4 质粒的转化与鉴定

4．3．5 质粒序列分析及注释

4．4 讨论

4．4．1 氟苯尼考耐药性与耐药基因的关系探究

4．4．2 质粒的测序与分析

第五章 全文结论

参考文献

附录

致谢

作者简历