副猪嗜血杆菌对替米考星野生型折点和药效学折点研究

摘要

副猪嗜血杆菌可以引起猪的格拉泽氏病，表现为纤维素性多发性浆膜炎、关节炎、脑膜炎和肺炎，发病特点多呈现地域特征，给全球的养殖业造成了巨大经济损失。替米考星作为大环内酯类动物专用药，对畜禽的呼吸道疾病具有很好的治疗作用。替米考星吸收速度快，半衰期长，肺部浓度高等药动学特点，进一步促进了其在兽医临床上的应用。但我国目前养殖业用药的不合理必然导致耐药现象的产生，耐药监测具有必要性和紧迫性。而耐药监测需要判定标准，目前我国并没有相关标准，主要参考CLSI中的折点，CLSI标准中并没有替米考星对副猪嗜血杆菌的折点规定。因此，为了监测耐药性产生，分析耐药现状和发展规律，更科学地指导临床用药和新药开发，本课题参考CLSI中折点制定的方法建立了符合我国国情的野生型折点和药效学折点，为折点的制定工作提供科学数据。
　　1替米考星对副猪嗜血杆菌野生型折点的制定
　　使用PCR方法对收集的103株副猪嗜血杆菌进行鉴定，结果全部呈现阳性，证明细菌全部为副猪嗜血杆菌。使用CLSI推荐的琼脂稀释法对103株副猪嗜血杆菌进行MIC测定，MIC50为1μg/mL，MIC90为4μg/mL。
　　将测得的MIC数据进行以二为底的对数转化，并使用Sigmastat软件进行正态性检验，结果P值为0.200，符合正态分布。使用Graphpad prism软件对数据进行非线性回归拟合，当模拟值N≤16时，模拟值与真值相差0株菌，差异最小。使用NORMINV函数分别设定野生型上限的概率为99.9％和下限的概率为0.1％，得到野生型分布范围为0.015μg/mL～16μg/mL。使用NORMDIST函数分别求出高于野生型上限的概率为0.18％，和低于野生型下限的概率为0.07％。根据规定，野生型折点为野生型分布的上限，所以制定野生型折点为16μg/mL。
　　2、替米考星对副猪嗜血杆菌的作用特点
　　根据副猪嗜血杆菌SH0165株MIC的测定结果，分别设定1/4MIC、1/2MIC、1MIC、2 MIC、4 MIC、8 MIC、32 MIC浓度的药物与细菌进行孵育，分别在0h、1h、2h、4h、8h、12h、24 h各取0.1mL，使用稀释法进行涂板计数。在36h对平板活菌数进行计数，以活菌数的对数值为纵坐标，以时间为横坐标作图，结果表明替米考星对副猪嗜血杆菌的作用呈现浓度依赖性。
　　3、替米考星在猪血浆和肺部的药动学研究
　　将12头健康仔猪平均分成两组，一组用来建立血浆药动模型，一组用来建立肺部药动模型，给药剂量都为40 mg/kg，给药方式为灌胃给药。
　　血浆药动组:分别在0.25 h、0.5 h、0.75 h、1h、2h、3h、4h、6h、8h、12h、24 h、36h、48 h、72 h、96 h采集血液2 mL，根据建立的高效液相检测方法检测血浆中药物浓度。使用Winnonlin软件对获得的药时数据进行拟合，采用的是有吸收的二室开放模型，得到的主要药动学参数:AUC24=32.10μg·h/mL，Tmax=3.50 h，Cmax=1.73μg/mL。
　　肺部药动组:根据制定的麻醉方案将动物麻醉，在给药前分别采集血液2mL，给药后分别在0.5 h、2h、4h、6h、8h、12h、24 h、36h、48 h、72 h、96 h通过肺泡灌洗技术注入50 mL生理盐水，并回收肺泡灌洗液，根据建立的高效液相检测方法检测灌洗液中药物浓度。另外检测灌洗液和血浆中尿素氮的浓度，结果表明，药物经过了约10倍稀释。使用Winnonlin软件对获得的药时数据进行拟合，采用的是非房室模型，得到的主要的药动学参数:AUC24=72.59μg·h/mL，Tmax=48 h，Cmax=4.72μg/mL。
　　4、替米考星药效学折点的建立
　　根据肺部药动获得的6头猪的AUC24数据:47.17μg·h/mL、93.76μg·h/mL、69.06μg·h/mL、75.57μg·h/mL、63.46μg· h/mL、86.50μg·h/mL。分别计算平均值为72.59μg·h/mL，标准差为16.69μg·h/mL。根据药动学参数符合对数正态分布，使用Crystalball软件进行蒙特卡洛模拟，得出10000头份的AUC数据。将药效学目标设定为30h，分别计算不同MIC下AUC/MIC的达标率，当MIC为1μg/mL时，达标率为100％，当MIC为2μg/mL时，达标率为76％，根据规定，达标率不小于90％的最大MIC即为药效学折点，所以制定替米考星对副猪嗜血杆菌的药效学折点为1μg/mL。
　　综上所述，本课题建立了副猪嗜血杆菌对替米考星的野生型折点。完善了动物肺泡灌洗技术，首次建立了替米考星在猪肺部的药动学模型。为动物肺部药动模型的建立提供了参考，为副猪嗜血杆菌对替米考星折点的建立提供了科学可信的数据。

目录

论文说明

声明

摘要

缩略语表

1 前言

1．1 立题依据

1．2 国内外研究进展和发展趋势

1．2．1 折点的定义

1．2．2 制定折点的组织

1．2．3 制定折点的程序

1．2．4 野生型折点研究进展

1．2．5 PK／PD折点研究进展

1．2．6 临床折点研究进展

1．3 研究内容和目标

1．3．1 研究内容

1．3．2 研究目标

2 材料与方法

2．1 药物与试剂

2．2 仪器与设备

2．3 动物与菌种

2．4 菌种分离、鉴定与保存

2．5 最小抑菌浓度(MIC)的测定

2．6 野生型折点的制定

2．7 PK／PD参数的选择

2．7．1 副猪嗜血杆菌生长曲线的绘制

2．7．2 最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)的测定

2．7．3 替米考星对副猪嗜血杆菌杀菌曲线的绘制

2．8 替米考星在猪血浆中的药动学研究

2．8．1 高效液相检测方法的建立

2．8．2 替米考星在血浆中的药动学实验

2．9 替米考星在猪肺泡液中的药动学研究

2．9．1 高效液相检测方法的建立

2．9．2 猪肺泡灌洗

2．9．3 尿素氮检测

2．9．4 替米考星在肺泡液中的药动学实验

2．10 数据处理

2．11 药效学折点的建立

3 结果与分析

3．1 副猪嗜血杆菌鉴定结果

3．2 副猪嗜血杆菌MIC测定结果

3．3 野生型折点的制定

3．4 替米考星对副猪嗜血杆菌的抗菌作用特点

3．4．1 副猪嗜血杆菌生长曲线

3．4．2 替米考星对SH0165的抑菌和杀菌活性

3．4．3 替米考星对副猪嗜血杆菌的杀菌曲线

3．5 替米考星在猪血浆中的药动学特点

3．5．1 定量方法学

3．5．2 替米考星在猪血浆中的药动学

3．6 替米考星在猪肺部的药动学特点

3．6．1 定量方法学

3．6．2 替米考星在猪肺部的药动学

3．7 药效学折点的制定

4 讨论

4．1 野生型折点的制定

4．1．1 药敏试验测定方法

4．1．2 药敏结果的差异性分析

4．2 药效学折点的制定

4．2．1 药动学参数的选择

4．2．2 药动模型的选择

4．2．3 流动相的确定

4．2．4 样品提取方法的优化

4．2．5 猪麻醉方案的制定

4．2．6 肺泡灌洗技术的建立

4．2．7 药效学目标

4．2．8 替米考星在猪血浆和肺部的药动学

5 全文总结

6 文献综述：折点的制定和肺部药动学的发展

参考文献

致谢

研究生简介

研究生期间获得荣誉

拟发表文章

附录