灰葡萄孢中甲基化相关基因的功能研究

摘要

灰霉病是一种由葡萄孢属真菌引起的重要病害，其中灰葡萄孢（Botrytis cinerea）的寄主范围最为广泛，可侵染200多种植物，每年造成严重的经济损失。表观遗传在动植物的生长发育过程中发挥重要的调控作用，我们通过氨基酸序列比对发现灰葡萄孢中存在三个分别编码DNA甲基转移酶、HP1（异染色蛋白1）和H3K9甲基转移酶的基因BC1G12419、BC1G06432和BC1G11188，分别命名为Bcdim-2，Bchp1和Bcdim-5，对三个基因的功能进行了初步研究，取得如下结果:
　　1.Bcdim-2基因开放阅读框4125bp，含有4个外显子，3个内含子，编码1025个氨基酸，含有DNA甲基转移酶保守结构域;Bchp1基因开放阅读框1118bp，含有6个外显子，6个内含子，编码244个氨基酸，含有HP1典型的两个保守结构域:CD(Chromo Domain)和CSD(Chrome Shadow Domain); Bcdim-5基因开放阅读框1752bp，含有4个外显子，3个内含子，编码357个氨基酸，含有Pre-SET、SET和Post-SET三个保守结构域。
　　2.Real-time PCR结果表明这三个基因在灰葡萄孢的营养生长、菌核形成和致病阶段均有表达，并且Bcdim-2基因在致病阶段表达下调，Bchp1基因在菌核形成和致病阶段表达下调，Bcdim-5基因在三个阶段的表达水平并无显著差异。
　　3.根据同源重组的原理，分别对这三个基因进行敲除，获得了基因的敲除转化子。深入研究发现，敲除Bcdim-2和Bchp1基因不会影响灰葡萄孢的菌丝生长速度、尖端形态、菌核产生、分生孢子形成及其致病力，但Bcdim-5基因敲除转化子的生长速率减缓25％左右，菌丝尖端形态不变;菌落表面出现白色菌丝纠集，菌核变小变圆，每皿菌核干重下降;分生孢子产生时间推迟，分生孢子量变少;在番茄、拟南芥、大豆上的致病力均有所降低。对Bcdim-5基因进行互补可恢复敲除转化子的菌丝生长速度、分生孢子和菌核形成能力，但其致病力不能完全恢复。
　　4.选取灰葡萄孢中的致病相关基因，检测其在Bcdim-5基因缺失突变体和B05.10菌株中的表达量变化，结果发现在突变体中大部分致病相关基因表达下调，推测Bcdim-5基因敲除菌株致病力的下降与致病相关基因的下调表达有关。
　　本研究初步证实Bcdim-5基因与灰葡萄孢的生长、产孢、菌核形成和致病过程相关，Bcdim-5基因敲除后影响致病相关基因的表达，而Bcdim-2和Bchp1基因缺失后不会影响菌株的正常生长发育，进而推测H3K9的甲基化对灰葡萄孢的生长、产孢、菌核形成和致病均有重要作用，而DNA的甲基化对这些生物学过程调控作用不明显。

目录

声明

摘要

缩略词表

第一章 前言

1 灰葡萄孢的研究进展

1．1 灰霉病的危害现状

1．2 灰霉病病原灰葡萄孢概况

1．3 灰葡萄孢的致病因子

1．4 灰葡萄孢的茵核形成相关因子

1．5 灰霉病的防治

2 甲基化修饰

3 研究目的及意义

第二章 灰葡萄孢中基因敲除和互补转化子的获得与验证

1 试验材料

1．1 菌株

1．2 培养基

1．3 载体

1．4 试剂

1．5 生物酶

1．6 实验仪器

2 试验方法

2．1 基因获得

2．2 基因表达量检测

2．3 基因敲除转化子的获得

2．4 灰葡萄孢基因敲除转化子的验证

2．5 Bcdim-5基因互补转化子的获得与验证

3 试验结果与分析

3．1 灰葡萄孢中Bcdim-2、Bchp1和Bcdim-5基因的序列分析

3．2 基因表达模式

3．3 基因敲除转化子的获得与验证

4 小结与讨论

第三章 灰葡萄孢中Bcdim-2、Bchp1和Bcdim-5基因功能初探

1 试验材料

1．1 试验菌株

1．2 培养基

2 试验方法

2．1 菌丝生长速度测定

2．2 转化子茵丝尖端形态

2．3 转化子产孢量测定

2．4 转化子菌落形态观察

2．5 转化子菌核产量测定

2．6 转化子致病力测定

2．7 Bcdim-5敲除转化子中致病相关基 因表达情况

3 试验结果

3．1 转化子的菌丝生长速度

3．2 转化子的菌丝尖端形态

3．3 转化子分生孢子产生情况

3．4 转化子的菌落形态及菌核形成

3．5 转化子的致病力测定

3．6 Bcdim-5敲除转化子中致病相关基因的表达

4 小结与讨论

讨论

总结与展望

参考文献

致谢

附录