利用RNAi技术提高棉花对棉铃虫的抗性及8个凝集素基因的克隆与进化分析

摘要

本文对利用RNAi技术提高棉花对棉铃虫的抗性进行了研究。RNA干涉（RNAi）已被发展为一种功能基因组学及抗虫方面重要的技术。在这一课题中，3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶（HMGR）催化了棉铃虫保幼激素（JH）合成的甲羟戊酸途径中一个重要的酶促反应，所以该基因被我们选为干涉的靶标基因。在该基因的编码序列中我们选择了两个不同的片段作为RNA干涉的靶标位点。通过农杆菌诱导的遗传转化，我们获得了表达双链RNA-HMGR（dsHMGR）的转基因棉花植株。PCR和Southern杂交验证了HMGR基因成功地整合进入了棉花基因组。RT-PCR和qRT-PCR验证了转基因棉花中双链RNA的高水平表达。在喂食了HMGR转基因棉花的叶片后棉铃虫(helicoverpa armigera)幼虫中HMGR的表达水平无论是在转录水平还是在翻译水平都显著下降了。另外，喂食了转基因叶片后，卵黄原蛋白（Vg，后代胚胎发育的重要营养来源）基因的相对表达量也下降了。多次生物测定的结果表明，喂食表达 dsHMGR的转基因叶片后，参试棉铃虫的发育及成活率均显著受到抑制。植物凝集素因具有特异性结合糖类的特性而被应用于抗虫领域，尤其是用于刺吸式口器害虫的防治。分子进化分析结果显示植物凝集素的分子进化关系与其物种的进化关系基本一致。另外，我们还克隆到了6个植物物种的8个凝集素基因并将它们连接入带有超标达启动子的植物转化载体用于对棉花的遗传转化。

目录

声明

缩略词表

前言

1.1问题的由来

1.2文献综述

2.材料和方法

2.1 实验材料

2.2实验方法

3 结果与分析

3.1 HMGi1和HMGi2棉花植株的遗传转化与分子检测

3.2 RT-PCR 及 qRT-PCR 验证转基因棉花植株高水平表达了dsRNA-HMGR

3.3 取食产生dsRNA-HMGR的转基因棉花植株抑制了棉铃虫HMGR和Vg基因RNA水平的表达

3.4 HMGR含量检测

3.5 表达dsRNA-HMGR的转基因棉花植株抑制了低龄棉铃虫幼虫的成活

3.6 表达dsHMGR的转基因棉花植株抑制了棉铃虫的生长发育

3.7植物凝集素超表达载体构建完成

3.8植物凝集素分子进化分析

4. 讨论

参考文献

附录

附录1.主要缓冲液配制

附录2.培养基配方

附录3.棉铃虫HMGR基因（HaHMGR）的cDNA序列

附录4.Protocols

附录5.本课题使用的引物

附录6.凝集素进化分析的物种

致谢