猪的一个喹赛多作用相关新基因的功能研究

摘要

喹赛多作为新一代喹噁啉类抗菌促生长剂，不仅保留了喹噁啉类药物的广谱抗菌和促生长双重作用，与其他同类药物相比还具有安全性高、用药后吸收快、消除迅速、残留期短等优点。本实验室于瑞同学通过mRNA差异显示技术研究发现，仔猪饲喂喹赛多后，肝脏组织中有八条差异基因，其中一条基因在人和小鼠的数据库中末检索到与其同源的基因和蛋白质，该基因的功能完全未知。崔文龙运用3'RACE和5'RACE技术获得新基因全长的cDNA序列。在NCBI的Gene数据库中检索发现，该基因具有种属特异性，位于猪的第11号染色体上，属于非编码RNA。目前，该基因的功能尚未被揭示，在喹赛多促进动物生长的分子作用机制中扮演的角色也不明了。因此，本文从以下几方面探索新基因的功能，并初步分析喹赛多作用可能的分子机制。
　　1、新基因超表达及其相关基因表达变化
　　将目的基因的全长(简写为CyaR)和可能的功能片段(简写为HFA)插入到真核表达载体pcDNA3.1(+)中，获得重组表达载体pcDNA3.1(+)-CyaR和pcDNA3.1(+)-HFA，测序结果表明插入的片段未发生突变，说明重组表达载体构建成功。
　　用LipofectamineTM2000试剂将重组表达载体pcDNA3.1(+)-CyaR和pcDNA3.1(+)-HFA转染至猪肾细胞PK-15，采用RT-qPCR技术检测转染后细胞中新基因RNA表达量，转染条件优化至最佳。转染重组表达载体之后，利用RT-qPCR检测细胞中6个基因的表达变化情况，包括与脂肪代谢、免疫应答、蛋白质代谢及其他功能相关的基因，如APOA-Ⅰ，CRBP-Ⅰ，FABP5，CALCB，FBXO32，FMO3。分析结果发现，转染了pcDNA3.1(+)-CyaR和pcDNA3.1(+)-HFA的PK-15细胞中APOA-I，CRBP-Ⅰ，FABP5，CALCB mRNA上调表达，FBXO32，FMO3 mRNA下调表达。
　　2、新基因沉默及其相关基因的表达变化
　　设计并合成新基因特异性siRNA，用LipofectamineTM2000转染试剂转染至PK-15细胞中，siRNA转染条件经RT-qPCR检测优化至最佳，其中siRNACyaR-sus-11可以明显抑制新基因的表达，与阴性对照组相比，抑制率可达87％左右。siRNA转染后，利用RT-qPCR检测PK-15细胞中APOA-Ⅰ，CRBP-Ⅰ，FABP5，CALCB，FBXO32，FMO3等基因的表达变化情况，结果发现新基因的表达后，这些基因的表达量变化趋势和新基因超表达后的情况相反。
　　3、新基因的定位
　　设计合成以FITC标记的特异性探针，利用RNA FISH技术检测正常的PK-15细胞中新基因RNA的位置，结果显示新基因的RNA绝大部分都分布在细胞质中，预示着该基因在细胞质中发挥生物学功能。
　　4、新基因超表达对细胞增殖的影响
　　将构建成功的两个重组超表达载体pcDNA3.1(+)-CyaR和pcDNA3.1(+)-HFA用LipofectamineTM2000试剂转染至PK-15细胞中，用实时细胞分析仪(RTCA)实时监测细胞的增殖情况，结果发现，与转染空质粒pcDNA3.1(+)相比，新基因的部分片段和全长都可以促进细胞的增殖，其中全长序列的促进作用略强。
　　5、与新基因RNA相互作用的蛋白质初步筛选
　　采用RNA pull down实验技术，将基因全长CyaR的RNA在体外用生物素标记，并和磁珠孵育过夜。PK-15细胞蛋白裂解液与磁珠-RNA共同孵育，将已孵育的磁珠-RNA-蛋白混合物低速离心，上清回收，进行SDS-PAGE凝胶电泳，质谱鉴定蛋白条带。筛选出来EZH2和核仁素可能与新基因的RNA结合。
　　新基因可能通过与EZH2结合，招募染色体修饰复合物PRC2，调节靶基因的表达。同时，新基因可能通过与核仁素的相互作用，影响核仁素的水解和磷酸化水平，从而影响核仁素对核糖体的生物合成以及对细胞周期的调节功能，调控细胞的增殖。
　　综上所述，新基因是位于细胞质中的非编码RNA，可能通过与蛋白质EZH2结合调节基因表达，与核仁素的结合调节细胞增殖。喹赛多可能通过新基因介导细胞内APOA-Ⅰ，CRBP-Ⅰ，FABP5，CALCB，FBXO32，FMO3等基因的表达变化，调节包括脂肪代谢、蛋白质代谢、免疫应答等过程。因此喹赛多可能通过调节新基因的表达，介导细胞的增殖，发挥促生长的作用。

目录

声明

摘要

缩略语表

1 前言

1．1 研究背景

1．2 研究内容

1．3 研究目的与意义

1．4 LncRNAs研究方法

2 材料与方法

2．1 材料

2．1．1 质粒和菌种

2．1．2 细胞

2．1．3 试剂与耗材

2．1．4 常用试剂配制

2．1．5 主要仪器及耗材

2．2 PK-15细胞培养

2．3 Western blotting

2．3．1 总蛋白提取

2．3．2 BCA法测定总蛋白浓度

2．3．3 SDS-PAGE

2．3．4 转膜

2．3．5 抗体孵育

2．3．6 化学发光显色

2．4 细胞总RNA提取及反转录

2．4．1 细胞总RNA提取

2．4．2 RNA琼脂糖凝胶电泳

2．4．3 RNA纯度鉴定与浓度测定

2．4．4 反转录合成cDNA

2．5 重组表达载体的构建

2．5．1 目的片段的扩增

2．5．2 空载质粒的扩大培养

2．5．3 超表达载体的构建

2．6 重组表达载体转染转染以及基因表达变化

2．6．1 重组表达载体转染PK-15细胞

2．6．2 RT-qPCR检验基因表达变化

2．7 新基因RNAi

2．7．1 siRNA设计合成

2．7．2 siRNA转染

2．8 RNA FISH

2．8．1 探针设计

2．8．2 细胞爬片

2．8．3 细胞爬片的固定

2．8．4 RNA FISH操作流程

2．9 RNA pull down

2．9．1 质粒酶切线性化

2．9．2 转录以及生物素标记

2．9．3 RNA pull down操作步骤

2．10 细胞增殖

2．10．1 细胞悬液准备

2．10．2 E-Plate 16准备

2．10．3 瞬时转染

3 结果

3．1 PK-15细胞的形态学观察

3．2 目的基因的超表达

3．2．1 超表达载体的构建

3．2．2 重组表达载体瞬时转染及结果检测

3．3 RNA干扰

3．3．1 siRNA选择及转染条件的确定

3．3．2 siRNA转染后相关基因表达变化

3．4 新基因RNA在细胞中定位

3．5 细胞增殖

3．6 与新基因互作的蛋白

4 讨论

4．1 新基因的超表达

4．2 新基因RNA在细胞中的定位

4．3 可能与新基因相互作用的蛋白质

4．4 新基因介导的细胞生物学功能

5 全文总结

6 文献综述 非编码RNA的功能及其研究方法

参考文献

致谢

作者简介

附录