狂犬病病毒G蛋白单克隆抗体的制备及初步应用

摘要

狂犬病是由狂犬病病毒（RABV）引发的人兽共患病，其发病后死亡率高达100％。目前没有有效治疗狂犬病的方法，所以狂犬病的诊断十分重要。RABV有5个结构蛋白，其中糖蛋白（G）是唯一暴露在病毒表面的结构蛋白，能够诱导机体产生中和抗体。本研究旨在制备出G蛋白单克隆抗体，并对其应用进行初步探索。
　　1、G蛋白单克隆抗体的制备：
　　本研究首先用纯化的狂犬病病毒SAD株的全病毒蛋白（RABV全蛋白）免疫6周龄雌性BALB/c小鼠，三次免疫后用构建的真核质粒pcDNA3.1-G进行加强免疫，待小鼠血清中G蛋白抗体水平达到要求后，进行PEG法细胞融合。经过间接ELISA法和间接免疫荧光法（IFA）筛选杂交瘤细胞后，获得4株G蛋白单克隆抗体，分别命名为6C3、6D1、6D12、6F3。其中6C3株为中和性抗体，滴度为53.3 IU/mL；用间接ELISA法检测杂交瘤细胞上清，效价分别为28、210、28、29，腹水效价分别为106、106、105、105；用小鼠抗体亚类鉴定试剂盒测得抗体亚型均为IgG2a（κ）；用非竞争ELISA法测得抗体亲和常数分别为5.2×108、1.7×108、6.1×107、5.0×108；用Western-blot法测得4株单抗与犬副流感病毒、犬瘟热病毒、犬细小病毒均无交叉反应；用IFA法测得4株单抗可以识别RABV固定毒株（LBNSE、B2c和CVS-11）和野毒株（DRV-AH-08和DRV-SX-15）；用辛酸-硫酸铵沉淀法分别从腹水中纯化4株单抗，SDS-PAGE检测可见高纯度轻链（25 KD）和重链（50 KD）；BCA法测定4株抗体浓度分别是1.79 mg/mL、1.52 mg/mL、1.03 mg/mL和1.34 mg/mL。
　　2、G蛋白单克隆抗体的初步应用：
　　将6C3株进行辣根过氧化物酶（HRP）标记，即 HRP-G，浓度为1.0 mg/mL，标记率为47%。间接ELISA工作浓度为2.0μg/mL；Western-blot工作浓度为0.25μg/mL。经过配对试验测得包被抗体为6F3，其包被浓度为3.35μg/mL，包被条件为4℃过夜；封闭液为5%脱脂奶粉，封闭条件为37℃孵育2 h；抗原反应条件为37℃孵育1 h；检测抗体为HRP-G，工作浓度为5.0μg/mL，工作条件为37℃孵育1 h；底物反应时间为15 min。
　　综上所述，本研究筛选到能稳定分泌抗RABV G蛋白的单克隆抗体4株，其中6C3株为中和抗体，将其进行HRP标记，并进行了双抗夹心ELISA方法建立的初步探究，为狂犬病毒的抗原检测方法和G蛋白相关的研究奠定基础。

目录

声明

缩略语表（Abbreviation）

第一部分前言

1.1狂犬病流行病学

1.2狂犬病临床特点

1.3狂犬病病理过程

1.4狂犬病病原学

1.5狂犬病防治措施

1.6抗狂犬病病毒单克隆抗体研究进展及应用

1.7 ELISA方法

1.8研究目的及意义

第二部分RABV G蛋白单克隆抗体的制备

2.1材料

2.2方法

2.3结果

2.4讨论及结论

第三部分RABV G蛋白单克隆抗体的初步应用

3.1材料

3.2方法

3.3结果

3.4讨论与结论

4.总结

参考文献

致谢