狂犬病病毒G蛋白的克隆表达及其V区特异性单克隆抗体的制备与鉴定

摘要

狂犬病(Rabies)是由狂犬病病毒(Rabies virus，RV)感染引起的致死性神经紊乱传染病。RV基因组为单股负链RNA，其具有五种结构蛋白，分别是N蛋白，P蛋白，M蛋白，G蛋白和L蛋白。在五种结构蛋白中，G蛋白在病毒结构蛋白中具有重要地位，它存在于病毒表面，既是病毒的主要保护性抗原，又在病毒侵染宿主造成神经系统疾病中具有重要作用，与病毒感染性直接相关。
　　本研究根据RV弱毒型LBNSE株G基因全序列，成功构建了原核表达载体pET-30a-G，用于完整表达RVG蛋白。重组表达质粒pET-30a-G转化入大肠杆菌表达株BL21(DE3)中，利用IPTG诱导，并采用SDS-PAGE和Western blot两种方法对其表达性进行分析，结果一致性的在蛋白分子量67 KDa附近出现了蛋白大量表达的条带，表明构建的pET-30a-G重组质粒正确表达G蛋白，大约为67 KDa，并且具有相应的蛋白反应原性，可用于后续研究提供研究基础。
　　同时，本研究进一步对RV弱毒型LBNSE株与野生型IMDRV-13株的G蛋白进行真核表达，并成功构建了两种不同真核表达载体pCAGGS-G/pCAGGS-13G。利用免疫荧光与RT-PCR的方法鉴定重组质粒的表达情况，结果免疫荧光出现了特异性的荧光信号，RT-PCR鉴定出现了特异性的条带，表明构建的两种真核重组表达质粒具有正确表达G蛋白的能力。该研究成果可用于后续研究中鉴定McAb的识别位点提供研究基础，并将为进一步揭示RVG蛋白生物学功能提供研究基础。
　　为制备RVG蛋白特异性单克隆抗体(McAb)及鉴定其识别范围，本研究采用人工合成多肽“PPDQLVNLHDFRSDEIEHLVVEE”与KLH的偶联物免疫小鼠，经筛选制备出一株阳性杂交瘤细胞，记作4D3，其亚类鉴定为IgG2b/κ链。利用构建好的表达载体pCAGGS-G/pCAGGS-13G鉴定McAb的结合范围。免疫荧光与Western blot分析显示:该株McAb与真核表达的人工减毒株LBNSE G蛋白可发生特异反应，而与强毒株IMDRV-13 G蛋白不反应。将免疫用多肽序列、毒株LBNSE相应序列和强毒株IMDRV-13相应序列相互比较，G蛋白的第264位氨基酸的改变直接影响该株McAb的结合，由于261位至264位氨基酸构成G蛋白V区线性表位，可推测该株McAb可识别G蛋白V区线性表位。本试验结果可为进一步研究G蛋白的结构、功能和毒株的初步筛查提供参考，为控制和消灭狂犬病做出相应贡献。
　　本实验室也设计了其他多肽序列的组合，正在进行单抗的制备，以期获得全覆盖的抗体组合，为狂犬病毒的基础研究和检测技术研究提供可靠的工具抗体。

目录

声明

摘要

英文缩略表

第一章 引言

1．1．1 RV G蛋白

1．1．2 G蛋白与宿主免疫的关系

1．1．3 G蛋白与宿主细胞受体的关系

1．1．4 G蛋白与病毒致病性的关系

1．2 RV中和抗体研究进展

1．2．1 研究背景

1．2．2 中和抗体应用于疾病预防

1．2．3 中和抗体检测方法

1．2．4 不同检测方法的应用范围

1．2．5 检测方法的评价标准

1．2．6 讨论

第二章 RV G蛋白的原核表达

2．1 实验材料

2．1．1 菌株、质粒、毒株

2．1．2 主要试剂

2．2 方法

2．2．1 引物设计

2．2．2 RT-PCR

2．2．3 PCR产物的克隆与测序

2．2．4 原核表达载体的构建

2．2．5 重组表达质粒的诱导表达

2．2．7 重组G蛋白的Western blot鉴定

2．3 结果与分析

2．3．1 RV G基因的克隆

2．3．2 克隆重组质粒的鉴定

2．3．3 重组表达质粒的鉴定

2．3．5 Western blot鉴定

2．4 讨论

第三章 RV G蛋白的真核表达

3．2．2 RT-PCR与克隆测序

3．2．3 表达质粒的构建与转染

3．2．4 重组质粒的表达鉴定

3．3 结果与分析

3．3．1 RV G基因的克隆

3．3．2 酶切鉴定

3．3．3 RT-PCR鉴定

3．3．4 IFA鉴定

3．4 讨论

第四章 RV G蛋白V区特异性单克隆抗体的制备与鉴定

4．1 实验材料

4．1．1 动物、质粒、毒株与细胞系

4．1．2 主要试剂

4．2 方法

4．2．1 杂交瘤细胞的制备与筛选

4．2．2 抗体效价测定及亚型鉴定

4．2．3 间接免疫荧光(IFA)鉴定

4．2．4 Western blot鉴定

4．3 结果与分析

4．3．1 杂交瘤细胞的制备与筛选

4．3．2 单克隆抗体亚型鉴定以及效价检测

4．3．3 Western blot鉴定

4．3．4 IFA鉴定

4．4 讨论

第五章 全文结论

参考文献

附录

致谢

作者简历