扁弯口吸虫、中华许氏绦虫、短颈鲤蠢绦虫线粒体基因组全序列的测定及分析

摘要

我国寄生虫病的种类多样，分布广泛，且感染率较高，不仅危害动物体健康，也危害着人类的健康。扁弯口吸虫、中华许氏绦虫、短颈鲤蠢绦虫作为水产养殖鱼类的重要寄生虫，目前对它们的研究主要集中在虫体形态结构、流行病学诊断和寄生虫病防治方面，而对其分子水平的研究较少，尤其是对其完整线粒体基因组方面的研究还未见报道。而线粒体 DNA是研究生物分子分类、动物的群体遗传、系统的分类等方面的一种理想标记。因此，本研究以扁弯口吸虫、中华许氏绦虫、短颈鲤蠢绦虫为研究对象，利用分子生物学方法，分别获得了它们的线粒体基因组全序列，并分析基因组的碱基组成、排列顺序、密码子的使用及系统发育分析等。
　　利用酚-氯仿抽提法提取虫体 DNA，依据保守区的序列设计引物，把基因组划分为多个片段，片段间有重叠区部分，再通过PCR扩增出线粒体的特定片段，经过纯化之后直接进行测序，然而由于PCR产物在直接测序时，引物端约有几十个碱基是测不出来的，因此需要将PCR的产物克隆，挑选3~5个克隆产物，使用通用引物测序，从而获得完整的序列信息，最后将所得到的序列拼接成完整的基因组全序列。对基因组进行分析，用 MEGA6.0软件采用最大似然法绘制进化树。得到的结果如下：
　　1.通过本研究，首次获得了扁弯口吸虫线粒体基因组全序列，并对它们的特征进行了分析，丰富了吸虫线粒体全基因组数据库，基于氨基酸水平的系统发育树从分子水平上探讨了扁弯口吸虫与其他吸虫的进化关系。扁弯口吸虫线粒体基因组大小为13796bp，包含12个编码蛋白质基因(PCG)，2个rRNA，22个tRNA以及1个非编码区(NCR)，AT含量64.29％，密码子具有碱基偏好性，以ATG和GTG作为起始密码子，TAG、TAA和T作为终止密码子，TTT(F)的使用频率最高，具有吸虫线粒体基因组的一般特征。系统发育分析表明，扁弯口吸虫呈独立的一支，相比较而言，不能得出其与所选的任意科的吸虫关系更近。
　　2.通过本研究，首次获得了中华许氏绦虫和短颈鲤蠢绦虫线粒体基因组全序列，并对它们的特征进行了分析，丰富了绦虫线粒体全基因组数据库，基于氨基酸水平的系统发育树从分子水平上探讨了二种绦虫与其他吸虫的进化关系。中华许氏绦虫和短颈鲤蠢绦虫线粒体基因组大小分别为13759bp，14504bp，都有12个编码蛋白质基因(PCG)，2个rRNA，22个tRNA以及2个非编码区，AT含量分别为60.30%和63.29%，密码子都具有碱基偏好性，且都以ATG和GTG作为起始密码子，TAG、TAA和T作为终止密码子，TTT(F)的使用频率最高，且两者的非编码区位置相同，但与其他绦虫不同，系统发育分析表明，二者的亲缘关系比其他绦虫更近。

目录

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缩略词表

1 前言

1.1.1 线粒体基因组特征

1.1.2 线粒体基因组的提取方法

1.1.3 测序方法

1.1.4 研究线粒体基因组的意义

1.2.1 扁弯口吸虫病简介

1.2.2 吸虫线粒体基因组研究进展

1.3.1 鲤蠢绦虫病简介

1.3.2 绦虫线粒体基因组研究进展

1.4 现代系统发育学中常用的系统发育建树方法

1.4.1 距离法

1.4.2 最大简约法(MP)

1.4.3 最大似然法(ML)

1.4.4 贝叶斯推断法

2.1 材料与方法

2.1.1 实验材料

2.1.2 实验方法

2.2 结果与讨论

2.2.1扁弯口吸虫线粒体基因组的结构和组成

2.2.2 编码蛋白质基因及密码子使用

2.2.3 rRNA与tRNA

2.2.4 非编码区

2.2.5 系统发育分析

3.1 材料与方法

3.1.1 实验材料

3.1.2 实验方法

3.2 结果与讨论

3.2.1 中华许氏绦虫线粒体基因组的结构和组成

3.2.2 编码蛋白质基因及密码子使用

3.2.3 rRNA与tRNA

3.2.4 非编码区

4.1 材料与方法

4.1.1 实验材料

4.1.2 实验方法

4.2 结果与讨论

4.2.1 短颈鲤蠢绦虫线粒体基因组的结构和组成

4.2.2 编码蛋白质基因及密码子使用

4.2.3 rRNA与tRNA

4.2.4 非编码区

4.2.5 系统发育分析

5 结论

参考文献

附录

致谢