猪胸膜肺炎放线杆菌弱毒疫苗冻干保护剂的研究

摘要

胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae，APP)是猪传染性胸膜肺炎(Porcine Contagious Pleuropneumonia，PCP)的病原体，能引起猪的一种高度接触性呼吸道传染病，是集约化猪场常见的猪病之一，死亡率高，对世界各地的养猪业均造成巨大经济损失。胸膜肺炎放线杆菌血清型众多，商品化的灭活疫苗和亚单位疫苗缺乏完全的交叉免疫保护力。为预防和控制这一疾病的发生和流行，对于安全、有效的新型疫苗的研发迫在眉睫。近年来各国都在积极研究基因缺失弱毒苗对猪传染性胸膜肺炎的保护效果，初步的动物实验结果已经表明弱毒苗可抵抗多种血清型菌株的攻击，交叉免疫保护力比传统疫苗更强，有望取代目前的灭活苗。但是，通过基因缺失的APP弱毒疫苗对外界抵抗力弱，菌株冻干保藏过程中容易死亡，影响弱毒疫苗的免疫效果和推广使用。鉴于此背景，本课题主要研究APP弱毒苗冻干保护剂，以提高APP的冻干存活率。本研究的主要内容包括以下几个方面：
　　1．基因缺失疫苗菌种的确定
　　通过 PCR方法鉴定菌种正确。然后对基因缺失 APP弱毒菌株生长特性进行研究，结果表明，其生长条件为37℃振荡培养，培养时要加入10％的血清和终浓度为10μg/mL的NAD(Nicotinamide adenine dinucleotide)。通过测定生长曲线得出菌株最佳收菌时间为接种后5-7h。
　　2．基础保护剂筛选
　　参考文献，配制了10种保护剂配方，对APP进行冻干预实验，成功确定3种具有良好保护效果的保护剂成分，分别为脱脂牛奶、海藻糖和甘油。
　　3．探究菌液、保护剂浓度比对冻干的影响
　　在脱脂牛奶、海藻糖和甘油3种成分的基础上进行保护剂配方的配制，并进行了菌液、保护剂浓度比的探究。分别设置菌液：保护剂=1:1、菌液：保护剂=1:2和菌液：保护剂=2:1的浓度比进行冻存实验和冻干实验。结果表明，菌液：保护剂=1:2的配方对样品菌株的保护效果最好，其中配方10%脱脂牛奶+4%海藻糖+2%甘油的保护效果最为显著，冻干率为36.7%。
　　4．正交实验筛选最优基础保护剂
　　在配方10%脱脂牛奶+4%海藻糖+2%甘油的基础上通过正交实验设计了9种保护剂配方，最终筛选出了最优基础保护剂配方为：9.5%脱脂牛奶+3.5%海藻糖+2.0%甘油，冻干率为38.0%。
　　5．添加优化因子优化保护剂配方
　　通过查阅文献，发现几种在其他菌株冻存具有良好保护效果的保护因子，分别为牛血清白蛋白、蔗糖、D-山梨醇、L-精氨酸、甘氨酸、NAD，通过冻存和冻干实验，结果表明这些优化因子对APP的保护效果并不显著，有的甚至产生明显的负效应，这说明保护剂成分具有一定的菌种特异性，并不是所有的保护剂对APP弱毒菌株都具有良好的冻干保护效果，应该根据情况适量添加。
　　6．重复验证试验
　　为了保证冻干保护剂效果的稳定性，对上述试验中具有较好保护效果的3种配方又进行了一次重复试验，结果显示保护剂配方9.5%脱脂牛奶+3.0%海藻糖+3.0%甘油冻干保护效果最好，冻干存活率达到72.07%。接着用此配方又进行了两次冻干验证试验，综合这三次冻干验证试验 APP弱毒苗的冻干存活率维持在65%-75%之间，平均冻干存活率为69.16%。
　　7．疫苗冻干保存期试验
　　将APP冻干菌粉置于－20℃保存，之后每隔一个月随机取出两瓶进行活菌计数并计算冻干存活率。目前已计数到4个月的冻干存活率(平均冻干存活率为66.48%)，活菌数仍然维持在108CFU/ml，表明本研究中使用的冻干保护剂具有较好的稳定保护效果。

目录

声明

缩略词表（Abbreviation）

第1章 文献综述

1.1 胸膜肺炎放线杆菌研究概述

1.2 真空冷冻干燥技术

1.3 冷冻干燥保护剂的研究进展

第2章 研究目的与意义

第3章 实验材料与方法

3.1 实验材料

3.2 实验方法

第4章 结果与讨论

4.1 实验菌株的鉴定结果

4.2 实验菌株生长特性

4.3 第一批基础保护剂配方筛选和冻存冻干实验结果

4.4 最佳菌液/保护剂比例筛选结果

4.5 与实验室原有保护剂配方对比实验结果

4.6 正交实验结果

4.7 优化实验结果

4.8 冻干保护效果验证

4.9 冻干再验证以及保存期实验结果

4.10 讨论

第5章 结论与展望

5.1 结论

5.2 展望

参考文献

致谢