基于CRISPR/Cas9技术构建IPEC-J2-Cas9细胞系的研究

摘要

基因组编辑技术通过对复杂基因组特定基因的精确改变，实现对基因功能的探索。基因组编辑技术主要包括锌指核酸酶技术（ZFNs）、类转录激活因子效应物核酸酶技术（TALENs）和成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR/Cas9）介导的第三代基因编辑技术。
　　其中II型CRISPR/Cas9系统以其操作简单、打靶效率高、周期短、成本低等优点，而广泛应用于现代生物学研究中。CRISPR/Cas9系统主要包括两种基本元素：起引导识别作用的sgRNA和起核酸内切酶作用的剪刀手Cas9蛋白。
　　本试验以体外培养的猪肠道上皮细胞IPEC-J2为研究对象，应用CRISPR/Cas9技术，以获得含有Cas9基因的IPEC-J2-Cas9单克隆细胞系，该细胞系可用于细胞水平基因敲除、插入等研究。该研究不仅丰富了猪细胞水平基因编辑技术，还补充完善了CRISPR/Cas9基因组编辑技术在猪肠道细胞水平的研究，为进一步研究猪肠道上皮细胞的基因功能提供重要材料。本研究分为以下几部分内容：
　　1.构建含有Cas9基因的LentiCas9-Blast、psPAX2和pMD2.G三质粒表达载体。
　　2.将能够表达Cas9基因的LentiCas9-Blast、psPAX2和pMD2.G三质粒共转染人肾脏上皮细胞（HEK293T）获得高滴度重组慢病毒。
　　3.重组慢病毒感染IPEC-J2，把Cas9基因整合到IPEC-J2细胞系中，经杀稻瘟霉素（Blasticidin）筛选、有限稀释法分离，获得含有 Cas9基因的多个单克隆细胞株。
　　4.经PCR检测Cas9基因是否插入成功，以及Western Blotting验证Cas9基因是否成功表达，观察鉴定转染Cas9与未转染细胞株生长情况，并比较IPEC-J2-Cas9细胞与IPEC-J2细胞生长曲线。
　　试验结果如下：
　　1．LentiCas9-Blast、psPAX2和pMD2.G三质粒共转染HEK293T细胞后，包装出高滴度重组慢病毒。
　　2.重组慢病毒转染处于对数生长期的IPEC-J2细胞系，用20μg/mL杀稻瘟霉素（Blasticidin）筛选，通过有限稀释法分离得到12株单克隆细胞株。
　　3.经Western Blotting鉴定，获得两株表达Cas9蛋白的IPEC-J2-Cas9细胞株。
　　4.通过生长曲线的比较，发现IPEC-J2-Cas9细胞与IPEC-J2细胞的生长曲线并没有明显差异。
　　结论如下：本课题应用基因组编辑技术CRISPR/Cas9系统，首次在猪肠道上皮细胞中成功建立Cas9基因表达的单克隆细胞系，该稳定转染细胞株（IPEC-J2-Cas9）与原细胞株（IPEC-J2）生长情况一致，可用于后续科学研究。本试验结果为猪肠道上皮细胞的基因功能研究提供了重要的细胞模型。

目录

声明

英 文 缩 略 词

前言

1.基因组编辑技术

1.1传统的基因打靶技术

1.2锌指核酸酶技术

1.3类转录激活因子效应物核酸酶（TALENs）

1.4 CRISPR/Cas系统

1.5小肠上皮细胞

1.6 研究主要内容和意义

1.7 研究技术路线

2.1 试验材料

2.2 主要试验方法

3.结果与分析

3.1 Cas9基因表达载体

3.2细胞形态学观察

3.3 HEK293T包装慢病毒

3.4重组慢病毒滴度测定结果

3.5 Blasticidin抗生素最低致死剂量的确定

3.6重组慢病毒转染IPEC-J2细胞系

3.7筛选IPEC-J2-Cas9单克隆细胞系

3.8 IPEC-J2-Cas9单克隆细胞系的验证

3.9 IPEC-J2-Cas9与IPEC-J2生长曲线结果

4.讨论

4.1包装重组慢病毒

4.2构建IPEC-J2-Cas9细胞系的应用价值

4.3 CRISPR/Cas9系统较其它基因组编辑技术优势之处

4.4基因组编辑技术展望及问题

5.结论

参考文献

致谢