GHRL和LPS对小鼠卵巢颗粒细胞的增殖和凋亡及激素分泌的调控作用

摘要

胃饥饿素(Ghrelin，GHRL)，是1999年在大鼠胃肠道内发现的含28个氨基酸的多肽，广泛分布于动物体内。越来越多的的研究证明，GHRL及其受体(GHSR-1α)在下丘脑-垂体-性腺轴上具有类似神经内分泌调控的作用，推测GHRL参与了生殖，特别是卵泡发育的调控。
　　脂多糖(Lipopolysacchrides，LPS)是革兰氏阴性菌细胞外壁的组成成分。奶牛瘤胃微生物在代谢过程中会产生游离的LPS，可经肠道吸收进入机体内环境，表明机体内可能长期存在低浓度的LPS，这种低浓度的LPS是否对卵泡发育产生影响，目前尚不清楚。
　　本实验以体外培养的小鼠卵巢颗粒细胞(GC)为模型，从受体和信号通路角度研究GHRL与LPS对卵巢颗粒细胞增殖、凋亡和生殖激素分泌的影响及作用机制，旨在探讨GHRL和LPS对卵泡发育的调节作用。研究内容和结果如下:
　　1.GHRL对卵巢颗粒细胞的作用及其机制
　　(1) GHRL受体GHSR-1α在GC细胞表达情况。
　　目的:研究GC细胞上是否存在GHRL受体以及受体基因表达与GHRL浓度的关系。
　　方法:本研究分别在GC细胞的培养液中添加浓度为0、10-6、10-7、10-8mol/L的GHRL，24h后裂解细胞收集蛋白，采用Western Blotting技术检测GHSR-1α的蛋白表达情况。
　　结果:GC细胞能够表达GHSR-1α蛋白，但是实验组GHSR-1α的表达量低于对照组，提示GHRL可能引起GC细胞产生针对GHRL的反馈抑制现象。
　　(2) GHRL对GC细胞周期和凋亡的影响
　　目的:研究不同浓度的GHRL对GC细胞周期与凋亡的影响。
　　方法:分别在GC细胞培养液中添加0、10-6、10-7、10-8mol/L的GHRL，24h后利用流式细胞仪(FCM)进行周期与凋亡的检测。
　　结果:FCM结果表明不同浓度的GHRL对GC细胞的周期没有显著影响;随着GHRL浓度的增加，GC细胞的凋亡逐渐上升（p＜0.01）;
　　(3) GHRL对生殖激素相关基因表达的影响
　　目的:研究10-7mol/L的GHRL对GC细胞在生殖激素分泌相关的基因表达上的影响。
　　方法:在GC细胞培养液中添加10-7mol/L的GHRL，24h后提取细胞总RNA，并利用Q-PCR技术研究生殖激素基因表达情况。
　　结果:10-7mol/L的GHRL能够促进与生殖激素分泌相关的基因表达(p＜0.05)，包括:FSHr，INH-βa，AR，LHcgr，P450scc，StAR等。
　　(4) GHRL对雌激素(E2)与孕酮(P)分泌的影响
　　目的:研究不同浓度的GHRL对GC细胞雌激素(E2)与孕酮(P)分泌的影响。
　　方法:分别在GC细胞培养液中添加0、10-6、10-7、10-8mol/L的GHRL，处理24h后，利用放射性免疫检验法(RIA)检测GC细胞培养液中的雌二醇(E2)与孕酮(P)含量的变化。
　　结果:10-6mol/L的GHRL能促进GC细胞分泌E2和P（p＜0.01），并且E2和P呈现对GHRL的剂量依赖性。
　　(5)探究GHRL对MAPK信号通路和Akt磷酸化的影响
　　目的:探究GHRL对MAPK信号通路和Akt磷酸化的影响。
　　方法:在GC细胞培养液中添加不同浓度的GHRL，24h后裂解细胞并收集蛋白，利用Western Blotting技术探究包括ERK，p-ERK，Akt，p-Akt，p-P38，p-P65在内的通路蛋白表达情况。
　　结果:ERK和Akt表达发生变化，表明GHRL对GC细胞的影响可能是通过MAPK信号通路和Akt磷酸化来实现的。
　　2.LPS对颗粒细胞的作用
　　(1) LPS对GC细胞增殖的影响
　　目的:为了分析LPS是否能够调控GC细胞增殖，凋亡和生殖激素分泌，并探索最佳作用浓度。
　　方法:利用CCK-8检测技术，用含LPS(0、50、100、150和200μg/ml)的培养液刺激GC细胞。
　　结果:低浓度的LPS（50μg/ml和100μg/ml）对GC细胞增殖有极显著性的促进作用(p＜0.01)，而高浓度的LPS（150μg/ml和200μg/ml）对GC细胞增殖有显著的抑制作用(p＜0.01)，其促进和抑制效果均有剂量依赖性。
　　(2) LPS对GC细胞周期和凋亡的影响
　　目的:研究50μg/ml的LPS对GC细胞周期与凋亡的影响。
　　方法:分别在GC细胞培养液中添加含有50μg/ml的LPS，处理24h后利用流式细胞仪(FCM)进行周期与凋亡的检测。
　　结果:FCM结果表明50μg/ml的LPS能够促进GC细胞由S期向G2期过渡，表明50μg/ml的LPS对GC细胞有促增殖的作用(p＜0.01);另外，50μg/ml的LPS能够显著抑制GC细胞的凋亡(p＜0.01)。
　　(3) LPS对生殖激素分泌相关基因表达的影响
　　目的:研究50μg/ml的LPS对GC细胞在生殖激素分泌相关的基因表达上的影响。
　　方法:在GC细胞培养液中添加50μg/ml的LPS，处理24h后提取细胞总RNA，利用Q-PCR技术检测与生殖激素分泌相关的基因表达情况。
　　结果:50μg/ml的LPS能够促进与生殖激素分泌相关的基因表达(p＜0.05)，包括:FSHr，INH-βa，AR，LHcgr，P450scc，StAR等。
　　(4) LPS对雌激素(E2)与孕酮(P)分泌的影响
　　目的:研究50μg/ml的LPS对GC细胞雌激素(E2)与孕酮(P)分泌的影响。
　　方法:别在GC细胞培养液中50μg/ml的LPS，处理24h后，利用放射性免疫检验法(RIA)检测GC细胞培养液中的雌二醇(E2)与孕酮(P)含量的变化。
　　结果:50μg/ml的LPS能促进GC细胞分泌雌二醇和孕酮（p＜0.01）。
　　综上所述，本研究发现GHRL与LPS对小鼠卵巢颗粒细胞的增殖，凋亡和生殖激素分泌的具有显著的调控作用，且GHRL的作用途径与MAPK，p-ERK和p-Akt相关。

目录

论文说明

声明

摘要

缩略词(Abbreviation words)

1 文献综述

1．1 胃饥饿素(GHRL)研究进展

1．1．1 胃饥饿素的理化特性

1．1．2 调节食欲和能量代谢功能

1．1．3 调节生长激素(GH)分泌和释放

1．1．4 对生殖系统的调控研究

1．2 脂多糖研究进展

1．2．1 脂多糖简介

1．2．2 脂多糖的作用通路研究进展

1．2．3 脂多糖对生殖器官的影响

1．3 研究目的和意义

2 实验研究

2．1 实验材料

2．1．1 实验动物及处理

2．1．2 主要仪器设备

2．1．3 主要试剂

2．1．4 主要溶液及相关缓冲液

2．2 试验方法

2．2．1 颗粒细胞的提取与培养

2．2．2 颗粒细胞总蛋白提取

2．2．3 蛋白免疫印迹(Western Blotting)

2．2．4 颗粒细胞增殖检测

2．2．5 颗粒细胞总RNA提取

2．2．6 反转录与Q-PCR反应

2．2．7 细胞周期检测

2．2．8 细胞凋亡检测

2．2．9 放射免疫分析法检测雌二醇(E2)和孕酮(P)水平

2．3 统计分析

3 试验结果

3．1 颗粒细胞上的GHSR-1α表达

3．2 GHRL对小鼠颗粒细胞生殖激素分泌相关的基因的影响

3．3 GHRL对小鼠卵巢颗粒细胞的周期影响

3．4 GHRL对小鼠卵巢颗粒细胞凋亡的影响

3．5 GHIU对雌二醇和孕酮分泌的影响

3．6 GHRL对MAPK信号通路和Akt磷酸化的影响

3．7 LPS对小鼠卵巢颗粒细胞增殖的影响

3．8 LPS(50μg／ml)对颗粒细胞周期的影响

3．9 LPS(50μg／ml)对颗粒细胞凋亡的影响

3．10 LPS(50μg／ml)对与生殖激素分泌相关基因表达上的影响

3．11 LPS(50μg／ml)对雌二醇和孕酮分泌的影响

4 讨论

4．1 GHRL对小鼠卵巢颗粒细胞的影响

4．1．1 GHSR-1α在颗粒细胞上的表达情况

4．1．2 GHRL对小鼠颗粒细胞的增殖，凋亡和激素分泌的调控作用

4．1．3 GHSR-1α在颗粒细胞上的通路研究

4．2 LPS对小鼠卵巢颗粒细胞的影响

5 总结

5．1 本研究的主要结论

5．2 本研究的创新点

5．3 本研究的不足

参考文献

致谢