猪瘟病毒荧光抗体的制备及其在猪瘟疫苗效力检验中的应用

摘要

猪瘟（Classical swine fever, CSF）是由猪瘟病毒（Classical swine fever virus, CSFV）引起各日龄猪均可感染的一种急性、热性高度接触性传染病，在全球范围内对养猪业造成巨大经济损失。
　　目前，我国猪群猪瘟防控的主要手段是疫苗免疫防控，所用疫苗是猪瘟兔化弱毒C株（LapinizedChinese strain, C-strain）疫苗，又称猪瘟兔化弱毒活疫苗，简称猪瘟疫苗。就当前猪瘟疫苗的生产工艺来看，我国现阶段使用的疫苗分为兔源组织苗、ST传代细胞源和原代犊牛睾丸细胞源。生产这些疫苗的厂家接近50家，因为各个厂家生产工艺的不同，所以临床上使用的猪瘟疫苗产品复杂，疫苗效价差异较大。疫苗效价是影响猪瘟疫苗质量的关键因素。测定猪瘟疫苗效价的传统方法是兔体反应热法。但是这种方法测定猪瘟疫苗效价易受兔子品种、性别、年龄、生理状态以及饲养环境等因素的影响，同时耗费人力、时间和经济成本。因此，建立一种快速稳定、方便易操作的疫苗效价测定方式具有重大的意义。
　　国内已有多人报道采用荧光定量PCR技术、巢式RT-PCR技术、酶联免疫吸附试验和免疫荧光技术来测定猪瘟兔源组织苗、ST传代细源和原代犊牛睾丸细胞源猪瘟疫苗效价。将这些方法的测定结果与兔体反应热法测定结果进行统计学分析比较时发现两者之间具有一定的数学相关性。证实了这些方法测定猪瘟疫苗效价的可行性。
　　本研究在课题组已建立的直接免疫荧光法基础上，大量制备了猪瘟病毒荧光单克隆抗体，建立了一种利用该荧光抗体测定猪瘟疫苗半数感染剂量(FAID50）的方法。主要研究如下：
　　1.猪瘟病毒AH9、4A7株单克隆抗体的大量制备
　　将液氮中保存的猪瘟病毒AH9、4A7株杂交瘤细胞复苏扩大培养后注射至经石蜡油预处理的Balb/c雌性小白鼠腹腔，大量收获两株单克隆抗体腹水共500mL。
　　2.猪瘟病毒AH9、4A7株单克隆抗体的纯化
　　将两株猪瘟病毒E2蛋白单克隆抗体经SiO2预处理、辛酸硫酸铵法两步提纯，获得AH9、4A7株纯化单克隆抗体，浓度分别为8.7mg/mL和10.1mg/mL。取等体积的两株纯化单克隆抗体进行混合，用E2蛋白包被的ELISA板测定混合后的单克隆抗体效价为1:102400。
　　3.猪瘟病毒荧光单克隆抗体的制备
　　将混合后猪瘟病毒单克隆抗体和异硫氰酸荧光素（FITC）按比例混合后经透析法标记。标记后荧光抗体的荧光信号较强，F/P值为2.006，在96孔细胞培养板中的最佳工作浓度为1:100。特异性试验结果表明，制备的荧光抗体在组织标本片检测中特异性较强，与日本脑炎病毒、伪狂犬病病毒、猪细小病毒和猪圆环病毒2型均无交叉反应。敏感性试验结果表明，用该荧光抗体建立的直接免疫荧光法检测的猪瘟疫苗达到10-6倍稀释度，同时与荧光定量PCR和反转录巢式PCR的比较发现，与荧光定量PCR敏感度相当，比反转录巢式PCR敏感度高1个数量级。
　　4.直接免疫荧光法测定猪瘟疫苗的FAID50
　　将分别接种猪瘟兔源组织苗、ST传代细胞源和原代犊牛睾丸细胞源猪瘟疫苗毒的96孔细胞板中的细胞固定，加入荧光抗体进行染色。荧光显微镜下观察结果，统计结果后按照Reed-Muench两氏法计算FAID50。
　　5. FAID50与兔体反应热法测定猪瘟疫苗效价的比较
　　将猪瘟疫苗按照各自生产厂家推荐的疫苗效价做一定稀释，然后将各稀释度疫苗接种大白兔测定兔体反应热，结果用兔体感染量（RID）表示。两者之间存在数学关系，即FAID50/RID值为13.9，方差为1.8。

目录

声明

缩略语表（Abbreviation）

1文献综述

1.1猪瘟病毒概述

1.2猪瘟疫苗研究进展

1.3荧光抗体标记技术研究进展

2研究目的与意义

3材料与方法

3.1材料

3.2方法

4结果与分析

4.1腹水的采集与保存

4.2标记抗体的制备与纯化

4.3 FITC标记混合单克隆抗体

4.4免疫荧光法应用于猪瘟疫苗效力检验

4.5直接免疫荧光法检测结果与巢式PCR检测结果比较

4.6直接免疫荧光法检测结果与荧光定量PCR检测结果比较

5讨论

5.1影响腹水采集量的因素

5.2影响猪瘟病毒在细胞内增殖的因素

5.3 FITC对直接免疫荧光试验的影响

5.4直接免疫荧光法测定猪瘟疫苗FAID50的准确性

5.5直接免疫荧光法替代兔体反应热法的可能性

6结论

参考文献

附录

致谢