柑橘体细胞杂种核仁共显性机制研究

摘要

核仁显性是一种普遍存在于植物和动物杂种中的表观遗传现象，与rRNA基因表达有关。在柑橘体细胞杂种中发现的核仁共显性现象为研究多倍体基因组遗传规律、基因表达调控提供了新思路。本实验通过荧光原位杂交(FISH)、蛋白免疫荧光等技术，分析柑橘体细胞杂种及其亲本的45S rDNA、DNA甲基化和H3K9ac在细胞核和染色体上的分布，并对DNA甲基化和H3K9ac与rRNA基因表达之间的关系进行了探讨，从分子细胞学角度研究核仁共显性产生原因。
　　1.45S rDNA在亲本和体细胞杂种中的分布
　　通过荧光原位杂交，观察发现哈姆林甜橙（Citrus sinensis‘Hamlin）有3个45SrDNA位点，2个为活性NORs;枸头橙(Citrus aurantium)中有4个45S rDNA位点，均具有转录活性，但其中一个活性较低;体细胞杂种BG（朋娜脐橙+枸头橙，Citrus sinensis‘Bonanza’+Citrus aurantium）有7个45S rDNA位点，只有1个不具有转录活性。这进一步验证了核仁共显性现象的存在，而且表明枸头橙中转录活性较低的NOR有可能在体细胞杂种中被激活。
　　2.DNA甲基化和H3K9ac在亲本和体细胞杂种中的分布
　　通过蛋白免疫荧光定位，分析发现在亲本和杂种中DNA甲基化和H3K9ac分布规律相同。在有丝分裂间期细胞核中，DNA甲基化在DAPI+异染色质区分布较多，而在常染色质区和核仁区分布较少;H3K9ac在常染色质区分布较多，异染色质区和核仁区分布较少。在中期染色体上，DNA甲基化分布均匀，而H3K9ac一般在染色体近中部和末端分布较多。
　　3.DNA甲基化和H3K9ac与45S rRNA基因表达的关系
　　结合荧光原位杂交和蛋白免疫荧光技术，发现亲本和体细胞杂种中活性NORs解聚部分DNA甲基化程度低，不具有活性的45S rDNA位点甲基化程度高，且枸头橙中活性较低的NOR在杂种中被激活后，甲基化程度明显降低，表明核仁共显性中45S rRNA基因表达与DNA甲基化有关。所有45S rDNA位点在亲本和体细胞杂种间期细胞核中H3K9ac乙酰化程度低，而在染色体上，活性NORs解聚部分乙酰化程度高，浓缩的45S rDNA位点乙酰化程度低，说明H3K9ac与核仁共显性45SrRNA基因表达也有一定的关系。

目录

声明

摘要

缩略词表

1 前言

1．1 课题的提出

1．2 文献综述

1．2．1 植物荧光原位杂交技术的原理和进展

1．2．2 荧光原位杂交的应用

1．2．3 核仁显性研究进展

1．3 研究目的

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 植物材料

2．1．2 免疫检测探针来源

2．1．3 探针来源

2．2 染色体制片

2．2．1 玻片预处理

2．2．2 荧光原位杂交染色体制片

2．2．3 蛋白免疫荧光染色体制片

2．3 荧光原位杂交

2．4 蛋白免疫荧光

3 结果与分析

3．1 免疫荧光分析

3．1．1 DNA甲基化抗体蛋白免疫荧光分析

3．1．2 H3K9ac蛋白免疫荧光分析

3．2 45S rDNA荧光原位杂交分析

3．3 DNA甲基化，H3K9ac乙酰化与45S rDNA的关系

3．3．1 DNA甲基化与45S rDNA的关系

3．3．2 H3K9ac乙酰化与45S rDNA的关系

4 讨论

4．1 亲本和体细胞杂种的45S rDNA的分布

4．2 DNA甲基化和H3K9ac在亲本和体细胞杂种中的分布

4．3 表观修饰和45S rRNA基因的表达

参考文献

致谢