Myostatin对猪肌卫星细胞和脂肪来源干细胞成脂分化的调控机制研究

摘要

肌内脂肪含量影响着猪肉的感官品质性状（多汁性、嫩度和风味等），同时它也与人类的胰岛素耐受性等疾病密切相关。存在于肌肉中的两种干细胞群体（脂肪来源干细胞和肌卫星细胞）均具有分化为脂肪细胞的特性，但是肌内脂肪细胞主要来源于哪种细胞并未得到证实。Myostatin(MSTN)是由肌细胞分泌的、对肌肉生长起负调控作用的分泌性蛋白，属于TGF-β超家族。本课题组前期的研究结果表明，MSTN处理肌卫星细胞后其脂肪分化潜能受到抑制，但是MSTN处理后的脂肪来源干细胞分化潜能却未受到抑制，由此推测:肌内脂肪细胞可能主要来源于脂肪来源干细胞。但是，MSTN如何对这两种细胞的成脂分化发挥不同的调控作用的机制仍是未知的，肌内脂肪细胞主要来源于脂肪来源干细胞的推测也未得到证实。为了解决以上问题，本论文主要开展两方面研究:首先用MSTN蛋白分别处理猪肌卫星细胞和脂肪来源干细胞，比较肌肉生长发育关键基因成肌分化因子1（MyoD）和脂肪发育关键基因过氧化物酶体增殖激活受体γ(PPARγ)在MSTN处理前后的表达情况;探讨MyoD对PPARγ基因的调控作用。然后，猪肌卫星细胞和脂肪来源干细胞经MSTN处理48 h，利用高通量表达谱测序的方法筛选MSTN处理前后差异表达的基因，并对差异表达基因影响细胞成脂分化的作用进行研究。主要研究成果如下:
　　1.MSTN对PPARγ和MyoD基因表达量的影响
　　首先用酶消化法分离猪的脂肪来源干细胞(ADSCs)和肌卫星细胞(MSCs)，然后分别通过免疫组化检测desmin和CD44的表达情况及油红O染色鉴定细胞的成脂分化能力对细胞进行鉴定，结果表示:成功分离了猪脂肪来源干细胞和肌卫星细胞。
　　脂肪来源干细胞和肌卫星细胞经浓度为100 ng/mL MSTN分别处理0h、24 h、48 h，然后检测PPARγ和MyoD在mRNA水平、蛋白水平及DNA甲基化水平上的表达情况。结果显示:在脂肪来源干细胞中，MSTN处理24 h组与0h组相比，PPARγ和MyoD的表达量没有显著性变化，但是MyoD的表达量有上升的趋势;MSTN处理48 h组与0h组相比，PPARγ的mRNA水平显著性上升了2.76倍，MyoD的mRNA水平显著性上升了8.33倍;从0h至48 h，PPARγ和MyoD的蛋白表达量持续增加，而启动子甲基化水平降低。在肌卫星细胞中，MSTN处理0h至48 h的过程中，PPARγ和MyoD的mRNA水平持续下降;与0h相比，24 h和48 h时的PPARγ和MyoD的蛋白表达量减少，启动子甲基化水平上升。
　　总之，在脂肪来源干细胞中MSTN促进了PPARγ和MyoD的表达，并且与PPARγ相比，MyoD的表达量在mRNA水平上上升的时间较早(24h)且上升的程度较高(8.33＞2.76)。而在肌卫星细胞中MSTN抑制了PPARγ和MyoD的表达。表明，在两种细胞中MSTN对PPARγ和MyoD表达量的影响不同，进而影响了脂肪来源干细胞和肌卫星细胞的成脂分化。
　　2.转录因子MyoD对PPARγ转录活性的影响
　　结果显示:在脂肪来源干细胞中超表达MyoD基因显著性上调了PPARγ的表达，并且超表达组的脂滴沉积量及脂肪标记基因(aP2和C/EBPα)的mRNA表达量都高于对照组，这表明超表达MyoD增强了细胞的成脂分化能力。而在肌卫星细胞中干涉MyoD基因显著性降低了PPARγ的表达，同时细胞的成脂分化能力受到抑制。
　　构建5个PPARγ启动子缺失片段，双荧光素酶活性分析结果显示pGL3-PPARγP3的活性最高。转染MyoD超表达载体(pcDNA-MyoD)显著提高了缺失片段的荧光值。以野生型pGL3-PPARγP3质粒为模板，将预测的MyoD结合位点和E-box位点突变后与pcDNA-MyoD共转染，发现突变型质粒与野生型质粒相比其荧光活性显著性降低。EMSA和ChIP-PCR分别从体外、体内证明了MyoD可以直接结合到PPARγ启动子区。
　　3.MSTN处理猪ADSCs和MSCs后差异表达基因的筛选及功能分析
　　猪脂肪来源干细胞和肌卫星细胞的MSTN处理组及各自的对照组于48 h时利用Trizol法提取细胞的总RNA，每组3个生物学重复共构建12个测序文库用于高通量表达谱测序。其中规定AM为脂肪来源干细胞MSTN处理组;AC为脂肪来源干细胞对照组;MM为肌卫星细胞MSTN处理组;MC为肌卫星细胞对照组。测序结果显示:AC与MC相比有257个差异表达基因（116个上调表达，141个下调表达）;AM与AC相比有139个差异表达基因（37个上调表达，102个下调表达）;AM与MM相比有741个差异表达基因(649个上调表达，92个下调表达);MM与MC相比有1640个差异表达基因（60个上调表达，1580个下调表达）。
　　将AM/AC组差异表达基因及MM/MC组差异表达基因经GO功能分析和KEGG通路分析，筛选与脂肪发育相关且在两个对比组中有不同的表达模式的差异基因，本研究中选择了两个基因（WISP2和KLF6）做后续的研究。油红O结果显示:超表达WISP2抑制了脂肪来源干细胞的成脂分化，而干涉WISP2则促进了脂肪来源干细胞的成脂分化。超表达KLF6促进了脂肪来源干细胞的成脂分化，而干涉KLF6则抑制了脂肪来源干细胞的成脂分化。
　　结论:①在脂肪来源干细胞中，MSTN促进MyoD的表达，然后MyoD作为转录因子可以结合到PPARγ的启动子区域并且对其转录活性起到促进作用，PPARγ的表达进而触发了细胞的成脂分化;而在肌卫星细胞中，MSTN抑制MyoD的表达，MyoD对PPARγ的促进作用中断，细胞的成脂分化也受到影响。②PPARγ和MyoD的表达受到启动子甲基化的影响。③WISP2和KLF6在MSTN处理两种细胞的过程中发挥着调控脂肪分化的作用。④肌内脂肪细胞主要来源于脂肪来源干细胞。

目录

论文说明

声明

摘要

常用中英文缩略词表

第一章 文献综述

1 引言

2 脂肪形成

2．1 脂肪组织的功能

2．2 脂肪细胞的来源

2．3 参与调控脂肪分化的主要转录因子

3 肌内脂肪

3．1 肌内脂肪的主要功能

3．2 肌内脂肪的发育

4 Myostatin

4．1 MSTN与肌生成

4．2 MSTN与脂肪生成

4．3 MSTN的其他功能

5 研究的目的与意义

第二章 MSTN对PPARγ和MyoD基因表达量的影响

1 前言

2 材料与方法

2．1 主要试剂和仪器

2．2 主要溶液的配制

2．3 ADSCs和MSCs的分离培养

2．4 细胞的常规培养

2．5 细胞的免疫化学染色

2．6 细胞的成脂诱导

2．7 油红O染色

2．8 DNA/RNA共提取

2．9 Q-PCR分析

2．10 DNA甲基化分析

2．11 Westem blotting分析

2．12 主要数据库及分析软件

2．13 统计学分析

3 结果与分析

3．1 猪ADSCs和MSCs的分离与鉴定

3．2 PPARγ和MyoD在mRNA水平上的表达情况

3．3 PPARγ和MyoD在蛋白水平上的表达情况

3．4 PPARγ和MyoD启动子区CpG岛甲基化分析

4 讨论

5 小结

第三章 转录因子MyoD对PPARγ转录活性的影响

1 前言

2 材料与方法

2．1 细胞系、载体

2．2 主要试剂及试剂盒

2．3 试验方法

2．4 应用到的主要生物信息学网站及分析软件

2．5 统计学分析

3 结果与分析

3．1 ADSCs中超表达MyoD对PPARγ基因的表达量及细胞成脂分化的影响

3．2 MSCs中干涉MyoD对PPARγ基因的表达量及细胞成脂分化的影响

3．3 PPARγ启动子缺失片段构建及转录活性分析

3．4 转录因子MyoD对PPARγ转录活性的影响

3．5 体外、体内试验确定MyoD结合于PPARγ启动子区域

4 讨论

5 小结

第四章 MSTN处理猪ADSCs和MSCs后差异表达基因的筛选及功能分析

1 前言

2 材料与方法

2．1 分离猪ADSCs和MSCs

2．2 测序样品收集

2．3 总RNA提取

2．4 mRNA纯化

2．5 cDNA文库构建和Illumina HiseqTM 2500平台的测序

2．6 差异表达基因(differentially expressed genes，DEGs)筛选

2．7 差异基因GO富集分析

2．8 差异基因Pathway富集分析

2．9 荧光定量PCR验证测序结果

2．10 WISP2和KLF6真核超表达载体的构建

2．11 细胞转染

2．12 RNA/蛋白共提取

2．13 油红O染色

3 结果与分析

3．1 Illumina HiSeqTM2500高通量测序及结果分析

3．2 与脂肪生成有关的基因的功能分析

4 讨论

4．1 高通量测序及结果验证

4．1 差异表达基因的获得及分析

4．2 WISP2对细胞成脂分化的影响

4．3 KLF6对细胞成脂分化的影响

5 小结

主要创新点

下一步工作建议

参考文献

在读期间发表论文题录

致谢