水稻Pi21和OsBadh2基因编辑改良空育131的稻瘟病抗性及香味品质

摘要

空育131是我国东北主栽的常规稻品种之一，该品种在低温和高湿的条件下易感稻瘟病。前期的研究表明Pi21和OsBadh2在隐性状态下分别具有抗稻瘟病和稻米香味的特性，而品种空育131的Pi21和OsBadh2基因都是显性的。本研究拟通过CRISPR-Cas9技术编辑空育131的Pi21和OsBadh2基因，改良空育131的稻瘟病抗性和香味品质。本研究的主要研究结果如下:
　　1.设计了4个靶位点(sgRNA1-4)特异地结合Pi21基因，针对Pi21基因的sgRNA1和sgRNA2靶位点构建的编辑载体，分别获得了2株和6株杂合突变体。针对Pi21基因的sgRNA3和sgRNA4靶位点构建的双靶位点编辑载体，获得了13株杂合突变体。针对sgRNA1和sgRNA2靶位点获得的8株杂合突变体，鉴定到5个单拷贝转基因植株，在T1代共获得12株无Cas9转基因位点的pi21纯合突变体。qRT-PCR和RT-PCR的结果显示Pi21基因在叶鞘中的表达量最高，其次是茎秆;3个纯合突变体(62-2、61-3和18-23)叶鞘和茎秆组织中Pi21基因的表达量与对照空育131相比均下降。
　　2.苗期室内接种稻瘟病的结果显示:空育131对5个检测的菌株均表现为感病，基因Pi21的纯合编辑材料62-2（缺失碱基C）和36-18（缺失4个碱基）对14-7303-1菌株有较强的抗性，但17-1（插入碱基A）对14-7303-1菌株感病，这3个编辑位点纯合家系对接种的另外4个菌株都表现为感病。共分离检测的结果表明抗病表型和Pi21的编辑位点共分离，说明植株的抗病反应确实是由于Pi21的碱基缺失引起的。农艺性状考察的结果显示:这3个编辑位点纯合家系(62-2、17-1和36-18)的主要农艺性状与野生型相比基本没有改变。比较测序的结果表明这3份材料中与Pi21基因连锁的LOC_Os04g32890基因序列与野生型一致，说明编辑Pi21基因时没有导致临近品质基因序列的改变。
　　3.针对OsBadh2基因的sgRNA1靶位点构建的单靶位点编辑载体，获得了2株杂合突变体;针对OsBadh2基因的sgRNA3和sgRNA4靶位点构建的双靶位点编辑载体，获得了7株杂合突变体。

目录

声明

摘要

缩写名词表

1 前言

1．1 研究问题的由来

1．2 文献综述

1．2．1 水稻遗传改良的现状概述

1．2．2 基因组编辑技术的种类

1．2．3 CRISPR-Caus9技术的研究进展

1．2．4 水稻稻瘟病研究进展

1．2．5 香味基因OsBadh2的研究进展

1．3 研究的目的和意义

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 植物材料

2．1．2 质粒载体和菌株

2．1．3 供试的稻瘟病菌株

2．2 实验方法

2．2．1 比较测序

2．2．2 靶位点的选择

2．2．3 CRISPR-Cas9单靶位点载体构建

2．2．4 CRISPR-Cas9双靶位点载体构建

2．2．5 转基因植株DNA的抽提及阳性检测

2．2．6 基因型鉴定(PCR-RE)

2．2．7 编辑株系的拷贝数检测

2．2．8 抽提RNA、RT-PCR和qRT-PCR检测基因表达量

2．2．9 稻瘟病抗性人工接种鉴定

3 结果与分析

3．1 品种空育131的Pi21和OsBadh2位点测序分析

3．2 Pi21基因的CRISPR-Cas9载体构建及遗传转化

3．3 Pi21基因的编辑位点检测

3．4 获得无Cas9转基因位点的纯合编辑株系

3．5 Pi21基因的表达谱分析及编辑位点纯合材料的表达量检测

3．6 pi21编辑位点纯合材料的稻瘟病抗性鉴定

3．7 pi21抗病材料的共分离检测

3．8 pi21编辑位点纯合材料的表型考察和农艺性状的考察

3．9 品质基因LOC_Os04g32890的比较测序

3．10 EMS诱变pi21材料的稻瘟病抗性鉴定

3．11 OsBadh2基因的CRISPR-Cas9载体构建及编辑位点检测

4 讨论

4．1 利用CRISPR-CaS9技术创造突变体的优势

4．2 突变概率在不同基因和不同靶位点之间的差异

4．3 培育抗稻瘟病水稻品种新途径的探讨

4．4 pi21稻瘟病抗性基因的评价

参考文献

附录

附录3 个人简介

致谢