梨轮纹病与干腐病的病原关系及轮纹病菌携带病毒多样性研究

摘要

轮纹病和干腐病是梨产区常年发生且为害严重的病害，对我国梨产业造成了严重的威胁。长久以来，梨轮纹病和干腐病被认为是由葡萄座腔菌属（Botryosphaeria）真菌引起的两种不同的病害，而对于我国梨轮纹病和干腐病病原菌的种类、分布、致病性以及其所携带真菌病毒的情况研究甚少。本研究对来源于我国不同省市梨产区分离得到的梨轮纹、干腐病菌进行了种类鉴定、致病性测定，根据其菌落特征及所含有dsRNA的情况筛选到不同的真菌病毒，并对真菌病毒的基因组结构、病毒粒子形态、对寄主致病力的影响进行了详细的研究，为进一步研究梨树轮纹病、干腐病发生规律及有效利用真菌病毒进行防治提供了参考依据，取得的研究结果如下:
　　从我国20个省、市梨主栽区采集表现轮纹或干腐症状的病斑组织，通过组织分离法共得到243份原始菌株，将其中129份经过单菌丝纯化后得到131株纯化菌株。根据菌株的形态学特征并结合其ITS、β-tubulin和EF1-α序列分析，可将上述纯化得到的葡萄座腔菌属真菌分为Botryosphaeria dothidea、B.rhodina、B.parva和B.obtusa四类。通过分析菌株的种类来源与其分布的关系，发现除来源于新疆和甘肃的样品上没有分离得到葡萄座腔菌属真菌外，其它地区的样品均分离得到了该属真菌，但数量和分类上存在差异，其中B.dothidea为梨上的优势种类，共计116株，而且北至吉林，南至云南均有分布，显示出其对不同地理环境的适应性。另外B.rhodina、B.parva和B.obtusa菌株数量分别为2、7和6株。而且菌株的分类与其症状之间也存在相关性，在表现轮纹症状的病斑上只分离得到了B.dothidea，而在表现干腐症状的病斑上却分离得到了B.dothidea、B.rhodina、B.parva和B.obtusa。
　　选取B.dothidea、B.rhodina、B.parva和B.obtusa的代表菌株分别接种梨1年生枝条，结果表明，接种B.dothidea菌株的枝条表现干腐症状和疣状突起症状，而接种其它3个种菌株的枝条只表现干腐症状，这些不同种类菌株对梨枝条的侵染条件也存在差异，其中，B.dothidea和B.parva菌株无伤接种和有伤接种均能导致接种部位产生症状，而B.rhodina和B.obtusa菌株只能通过伤口侵染使接种部位表现症状。当上述菌株接种离体梨成熟果实时，B.parva、B.rhodina和B.obtusa菌株所造成的病斑显著大于B.dothidea菌株所产生的病斑。因此，葡萄座腔属菌的侵染途径及不同种病菌对梨的危害可能存在差异。综上所述，B.dothidea为梨轮纹病和干腐病常见的病原，而B.parva、B.rhodina和B.obtusa只引起梨干腐病。该结果系统研究了我国梨上的Botryosphaeria病原菌种类的多样性及其接种后所表现症状间的相关性。
　　通过观察菌株在PDA平板上的形态特征发现，243株原始菌株中有7株菌株生长异常，其中4株菌株生长很慢、气生菌丝弱且易产生黑色色素;2株菌株的中央菌丝气生性较弱、边缘菌丝稀薄，且在边缘易产生扇变;1株菌株的菌丝扩展快、但气生菌丝消失、且易产生墨绿色的色素。提取了所有原始菌株的DNA及dsRNA，发现均没有DNA病毒的侵染，而在表型异常的菌株中均提取到了dsRNA，在表型正常的菌株中有95株B.dothidea提取到了dsRNA，其余菌株均未提取到dsRNA。
　　从分离于河南郑州的一株气生菌丝稀少、致病力丧失的菌株YZN115中发现了一种新的dsRNA病毒，将其命名为Botryosphaeria dothidea RNA virus1(BdRV1/YZN115)。BdRV1/YZN115的基因组包含5条dsRNA，大小分别为2397、2184、1967、1131和1060 bp，每条dsRNA包含1个开放阅读框。BdRV1/YZN115和Aspergillus fumigatus tetramycovirus-1（AfuTmV-1）有较近的亲缘关系，其中，BdRV1/YZN115的dsRNA1-4编码的蛋白氨基酸序列分别和AfuTmV-1编码的相应蛋白具有55％、47％、43％和53％的相似性。BdRV1/YZN115的dsRNA1、3和4分别编码依赖RNA的RNA聚合酶(RdRp)，甲基转移酶(methyltransferase)和P-A-S-rich类似蛋白（PASrp-like），而dsRNA2和dsRNA5编码的蛋白功能未知。经超速离心纯化后，BdRV1/YZN115的核酸和蛋白能从产物中获得，但免疫电镜结果表明BdRV1/YZN115没有形成病毒粒子。BdRV1/YZN115可以通过分生孢子和菌丝进行接触传播，得到的传毒衍生菌株也表现出生长异常及致病力丧失的特性。
　　从分离于湖北武汉的一株气生菌丝稀少、致病力下降的菌株EW220中发现了一种双节段dsRNA病毒，将其命名为Botryosphaeria dothidea botybirnavirus1(BdBRV1)。其中，dsRNA1大小为6434 bp，GC含量为48.1％，该dsRNA只包含1个开放阅读框(ORF1，nt546-6323)，编码1925个氨基酸，包含1个RdRp保守结构域;dsRNA2大小为5986 bp，GC含量为57.1％，包含1个开放阅读框(ORF2，nt568-5671)，编码1767个氨基酸。DsRNA1和dsRNA2的5'-末端非翻译区长度分别为545和567 nt，且这部分序列高度相似，3'-末端非翻译区长度分别为111和115nt，其中有63个核苷酸序列一致。BdBRV1的dsRNA1和dsRNA2编码的蛋白序列和Sclerotinia sclerotiorum botybirnavirus1(SsBRV1)所编码的蛋白相似性为82％和74％，但相似序列的分布不均匀，其中一些区域的相似性达到了90％，而最低区域只有39％。BdBRV1的病毒粒子为球形，直径约为37 nm，结构蛋白分子量大小约为100 kDa、90 kDa和80 kDa。BdBRV1能够降低B.dothidea菌株的生长速率，且使其致病力下降。
　　从分离于江西鹰潭的一株表现正常的菌株GY25中分离得到了一种dsRNA病毒，将其命名为Botryosphaeria dothidea victorivirus1(BdV1)。BdV1基因组大小为5322 bp，包含两个重叠的开放阅读框(ORF)，其中，ORF1编码743个氨基酸(nt512-2743)，ORF2编码840个氨基酸(nt2743-5265)。ORF1编码的氨基酸序列和Rosellinia necatrix victorivirus1（RnV1）编码的衣壳蛋白相似性最高，为37％(Evalue=8e-101)，ORF2编码的氨基酸序列和Beauveria bassiana victorivirus NZL/1980（BbV-NZL/1980）编码的RNA-directed RNA聚合酶相似性最高，为44％(Evalue=0)。BdV1在翻译链的5'-端存在一个小ORF，但所预测的氨基酸序列在NCBI网站上没有比对到任何具有同源性的已知蛋白。

目录

声明

摘要

缩略语表

第一章 文献综述

1．1 梨轮纹病和干腐病的研究进展

1．1．1 梨轮纹病和干腐病病原学研究

1．1．2 B．dothidea诱导寄主表现轮纹和干腐症状的机理

1．1．3 梨轮纹病和干腐病的防治

1．2 侵染我国果树的葡萄座腔菌科真菌的种类多样性

1．3 真菌病毒

1．3．1 真菌病毒的分类

1．3．2 真菌病毒的传播

1．3．3 影响病毒传播效率的因素

1．3．4 真菌病毒和病原真菌互作研究

1．3．5 真菌病毒和弱毒现象

1．3．6 其它能导致弱毒现象的真菌病毒

1．3．7 真菌病毒在生物防治上的应用潜力

1．4 侵染木本真菌的真菌病毒研究进展

1．5 研究的目的和意义

第二章 梨轮纹病菌和干腐病菌菌株的分离和致病性测定

2．1 引言

2．2 试验材料

2．3 试验方法

2．3．1 病菌分离和纯化

2．3．2 菌落形态的观察

2．3．3 分生孢子的诱导

2．3．4 菌株DNA的提取

2．3．5 引物设计与合成

2．3．6 PCR扩增

2．3．7 PCR产物的回收与纯化

2．3．8 连接

2．3．9 热击转化

2．3．10 阳性克隆的PCR鉴定

2．3．11 阳性克隆测序和系统进化树分析

2．3．12 不同菌株致病性的测定

2．4 结果与分析

2．4．1 田间症状观察

2．4．2 病原菌的形态学鉴定

2．4．3 病原菌的分子鉴定

2．4．4 病原菌的致病性分析

2．5 讨论

第三章 葡萄座腔菌不同菌株中dsRNA病毒的检测

3．1 引言

3．2 试验材料

3．3 试验方法

3．3．1 葡萄座腔菌菌株的分离

3．3．2 DNA提取

3．3．3 dsRNA提取

3．3．4 核酸电泳分析

3．3．5 用DNase Ⅰ和S1核酸酶处理dsRNA样品

3．4 结果和分析

3．4．1 菌株的表型

3．4．2 菌落异常菌株的致病力

3．4．3 供试菌株DNA和dsRNA的提取结果

3．5 讨论

第四章 五节段dsRNA病毒BdRV1分子特性及生物学特性研究

4．1 引言

4．2 试验材料

4．2．1 供试菌株

4．2．2 供试植物

4．3 试验方法

4．3．1 菌落形态观察、生长速率及致病力测定

4．3．2 DsRNA病毒全长cDNA克隆

4．3．3 DsRNA片段cDNA序列的拼接及分析

4．3．4 菌株YZN115单分生孢子后代的分离

4．3．5 菌株YZN115的弱毒特性及dsRNA的水平传染

4．3．6 病毒粒子的提取

4．3．7 病毒粒体的透射电镜观察

4．3．8 病毒粒体的核酸和结构蛋白的检测

4．3．9 原生质体的制备

4．3．10 病毒粒体的转染

4．3．11 原生质体再生法对病毒的脱除

4．3．12 原核表达载体的构建和蛋白诱导表达

4．3．13 表达蛋白的可溶性分析

4．3．14 His标签蛋白的纯化

4．3．15 His标签蛋白换缓冲液和浓度的测定

4．3．16 多克隆抗体的制备

4．3．17 真菌总蛋白的提取

4．3．18 Western blot分析

4．3．19 真菌中病毒粗提液的小量制备

4．3．20 间接ELISA

4．3．21 免疫捕捉RT-PCR(IC-RT-PCR)

4．3．22 免疫电镜

4．3．23 数据的统计方法

4．4 结果与分析

4．4．1 葡萄座腔菌菌株YZN115的生物学特性及dsRNA的检测

4．4．2 dsRNA片段的全长cDNA序列的分析

4．4．3 BdRV1的垂直传播

4．4．4 BdRV1的水平传播

4．4．5 水平传毒试验中亲本菌株和衍生菌株的区分

4．4．6 传毒衍生菌株表现畸形生长和弱毒特性

4．4．7 BdRV1在不同来源B．dothidea菌株中的分布和序列多态性

4．4．8 从纯化的BdRV1／YZN115样品中获得病毒的dsRNA和蛋白

4．4．9 BdRV1的dsRNA4蛋白全基因序列的获得和原核表达载体构建

4．4．10 多克隆抗体PAb-p4的效价分析

4．4．11 多克隆抗体PAb-p4识别BdRV1编码的蛋白

4．4．12 病毒的结构

4．4．13 多克隆抗体的IC-RT-PCR分析及对BdRV1／YZN115病毒的识别

4．4．14 BdRV1的转录组数据统计

4．4．15 转录组序列GO和KEGG分析

4．4．16 差异表达基因的筛选及功能分类

4．5 讨论

第五章 双节段dsRNA病毒BdBRV1分子特性和生物学特性研究

5．1 引言

5．2 试验材料

5．2．1 供试菌株

5．2．2 供试植物

5．3 试验方法

5．3．1 菌株生物学特性

5．3．2 DsRNA提取和纯化

5．3．3 BdBRV1全长cDNA的克隆

5．3．4 PCR产物测序

5．3．5 DsRNA片段cDNA序列的拼接及分析

5．3．6 BdBRV1病毒粒子特征

5．3．7 BdBRV1的水平和垂直传播

5．4 结果和分析

5．4．1 菌株EW220的生物学特性及dsRNA的检测

5．4．2 BdBRV1的基因结构和特性分析

5．4．3 BdBRV1病毒粒体的负染观察及核酸、结构蛋白的检测

5．4．4 BdBRV1病毒的系统进化分析

5．4．5 BdBRV1病毒垂直传播能力

5．4．6 BdBRV1病毒的水平传播能力

5．4．7 BdBRV1病毒的生物学特征

5．5 讨论

第六章 一种侵染梨轮纹病菌的全病毒基因组的分析

6．1 引言

6．2 试验材料

6．2．1 供试菌株

6．2．2 供试植物

6．3 试验方法

6．4 结果和分析

6．4．1 菌株GY25的生物学特性及dsRNA的检测

6．4．2 BdV1的基因结构和特性分析

6．4．3 BdV1的的系统进化分析

6．5 讨论

第七章 全文结论和展望

7．1 结论和展望

7．2 创新点

参考文献

附录

附录5 博士期间发表论文

致谢