以离子液体为功能单体的碳纳米管表面Bt蛋白分子印迹聚合物的制备及其性能研究

摘要

苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis, Bt）杀虫晶体蛋白，是Bt芽孢形成初期产生的具有特异性杀虫活性的伴胞晶体蛋白，简称 Bt蛋白，又称δ-内毒素。Bt蛋白引起的相关人类健康和环境生态风险问题，要求我们必须对转基因作物和生物农药释放Bt蛋白的种类和含量，及其在环境中的残留、迁移、转化和生物富集过程实行严格监控，而快速、准确、高效以及特异性提取、分离、纯化和检测方法的建立对Bt蛋白的有效监控具有举足轻重的作用和意义。
　　分子印迹技术是指以目标分析物为模板，采用人工方法合成对目标分析物具有特殊结合位点及空间记忆效应的聚合物的技术。表面分子印迹技术是在传统的包埋法基础上发展起来的，其特点是在聚合体系中引入固体基质，使模板分子、功能单体和交联剂之间的反应发生在固体基质表面。这种构建在基质表面的分子印迹聚合物，由于印迹位点易于暴露在基质表面，因此目标分析物可以在基质表面形成的特异性识别位点中自由进出，以克服传统包埋法在蛋白质分子印迹方面存在的缺陷。溶胶-凝胶技术反应条件温和、表面修饰过程简单、材料刚性和溶胀情况优于聚合物材料，将溶胶-凝胶技术与表面分子印迹技术相结合可以给分子印迹材料赋予更多优越的性能。
　　由于制备分子印迹聚合物过程中需要使用大量的高纯度蛋白质作为印迹模板，考虑到 Bt蛋白标准品价格昂贵，本论文从苏云金芽胞杆菌菌体培养液中提取 Bt Cry1Ac蛋白，然后对提取的粗蛋白进行酶解，得到高纯度的Bt Cry1Ac蛋白；以 Bt Cry1Ac蛋白为模板分子，KH550修饰的碳纳米管为基质，氯化1-三甲氧基硅丙基-3-甲基咪唑离子液体（[TMSPMIM]Cl）为功能单体，四乙氧基硅烷（TEOS）为交联剂，采用溶胶-凝胶法在碳纳米管表面接枝一层Bt Cry1Ac蛋白分子印迹聚合物，并对合成及吸附条件进行优化，对合成的分子印迹聚合物的比表面积、表面形貌、印迹效果以及表面基团等进行评价。主要内容如下：
　　1. Bt Cry1Ac蛋白的获取经历了菌体培养、洗芽孢、蛋白提取、等电点沉淀、酶解、等电点沉淀以及冷冻干燥等多个步骤。菌体培养条件为：培养温28℃；转速200 r/min；培养时间72 h。Bt Cry1Ac蛋白提取液为pH110.05 mol/L NaCO3&0.05 mol/L EDTA溶液。等电点沉淀条件：3 mol/L CH3COONa调节pH值至5.5左右。酶解条件：胰蛋白酶溶液与Bt Cry1Ac蛋白粗提液最佳比例为1：150，酶解时间1.5 h，酶解温度37℃。
　　2.分子印迹聚合物合成时各反应物的最佳配比为：Bt Cry1Ac蛋白12.5 mg，[TMSPMIM]Cl180 mg，TEOS2.5 mL，pH9.9 Tris-HCl缓冲溶液25 mL，KH550修饰碳纳米管10 mg。首先，功能单体和模板分子Bt Cry1Ac蛋白预聚合12 h，然后再加入TEOS在4℃的条件下磁力搅拌48 h；洗脱蛋白的最佳条件：超声5 min，pH9.9 Na2CO3-NaHCO3溶液作为洗脱缓冲液，洗脱率可以达到68.45％；吸附的最佳条件：4℃低温震荡6 h，pH8.9 Tris-HCl溶液溶解蛋白，材料浓度为3 mg/mL。
　　3.性能评价的结果：红外图谱表明碳纳米管表面成功嫁接上具有三维网状结构的硅胶聚合物层。研究不同含量离子液体合成的分子印迹和空白印迹聚合物比表面积和吸附容量的关系，发现分子印迹聚合物对Bt Cry1Ac蛋白主要以特异性吸附为主；分子印迹聚合物对Bt Cry1Ac蛋白的最佳吸附量为18.29 mg/g，印迹因子为2.05。

目录

声明

缩略语表

第一章 文献综述

1.1分子印迹技术简介

1.2 Bt蛋白简介

1.3离子液体

1.4碳纳米管

1.5溶胶-凝胶法制备分子印迹聚合物

1.6蛋白质分子印迹技术

1.7论文选题思路

第二章 实验材料以及试验方法

2.1实验所用药品

2.2实验仪器

2.3 Bt培养及Bt蛋白的提取

2.4 Bt蛋白分子印迹聚合物的制备

2.5碳纳米管表面Bt蛋白分子印迹聚合物的条件优化

第三章 结果与分析

3.1 光学显微镜观察苏云金芽孢杆菌

3.2 Bt蛋白的电泳

3.3 分子印迹聚合物合成及吸附条件的优化

3.4 分子印迹聚合物的性能表征

3.5总结

展望

参考文献

致谢