青、精饲料对草鱼池塘水体微生物影响研究

摘要

健康养殖的关键因素是养殖水体中生态环境状况，而水体中微生物群落结构多样性和理化因子状态对健康养殖发挥着重要作用。目前，养殖池塘中氮素积累普遍过高，对水体及养殖对象产生了严重危害。微生物在池塘氮素转化中发挥着至关重要的作用，研究池塘中微生物丰度和群落结构对养殖水体氮素调节具有重要意义。本文以运用荧光定量PCR(RT-PCR)和高通量测序技术（Illumia Miseq PE300）比较研究了精、青饲料池塘水体微生物丰度和群落结构多样性随养殖周期的动态变化情况，同时也调查了养殖池塘水体氨氧化细菌(AOB)季节变化。运用统计学方法，探究了池塘水体环境因子与微生物群落结构及AOB丰度之间的关系，为池塘水质调控提供参考资料。主要研究结果如下:
　　1.两种饲料池塘水体中微生物丰度及群落结构的比较
　　(1)投喂不同饲料池塘间氨氮、亚硝态氮浓度差异显著，硝态氮差异不显著。氨氮浓度表现为青饲料塘底层水（0.83±0.18mg/L）显著低于精饲料底层水(1.51±0.99mg/L)，亚硝态氮浓度表现为青饲料塘表层水（0.06±0.05mg/L）、底层水(0.06±0.05mg/L)分别均显著低于精饲料表层水（0.13±0.08mg/L）、底层水（0.13±0.09mg/L）。而相同饲料池塘表层水与底层水之间氨氮、硝态氮及亚硝态氮均无显著差异。
　　(2)养殖池塘水体细菌16S rRNA基因丰度波动范围在（2.81±0.64）×109～（8.63±1.01）×1010copies/mL。两种饲料池塘细菌16S rRNA基因丰度差异显著，九月份青饲料塘细菌16S rRNA基因丰度显著低于精饲料塘;养殖池塘不同水层细菌16S rRNA基因丰度差异显著，青、精饲料塘中均表现为:八月份表层水体细菌16SrRNA基因丰度显著高于底层水体。
　　(3)青饲料塘微生物群落结构多样性高于精饲料塘。池塘水体中优势菌群为:变形杆菌门(24.28％-48.22％)、蓝藻门(5.9％-37.61％)、拟杆菌门(5.4％-34.82％)和放线菌门(8.2％-22.37％)。青饲料塘这四个主要优势种群相对丰度与精饲料塘虽无显著差异，但存在细微区别。青饲料塘中变形杆菌门与放线菌门相对丰度高于精饲料塘;与此相反地，青饲料塘中拟杆菌门相对丰度低于精饲料塘。属水平下，未分类丛毛菌属相对丰度青饲料塘均显著高于精饲料塘;芽孢杆菌属、不动杆菌属及气单胞菌属相对丰度青饲料塘显著低于精饲料塘。
　　(4)聚类及相似性分析结果表明，不同饲料池塘微生物群落结构相似度较低，而相同饲料池塘微生物群落结构相似度较高，表明饲料对微生物群落结构产生了一定影响;而相同月份的池塘水体微生物群落结构相似度高，不同月份间相似度低，表明养殖池塘微生物群落结构存在季节性变化。
　　(5)应用典型相关分析(CCA)分析各类型池塘环境因子与微生物群落结构之间的关系，Axis1与溶解氧、水温、总有机碳达到了显著性正相关水平;Axis2与水温、硝态氮和亚硝态氮达到了显著性正相关水平，与氨氮达到了极显著性负相关水平;结果表明溶解氧、水温及总有机碳对微生物群落有着重要影响。
　　2.池塘水体氮循环微生物对两种饲料的响应
　　本研究分析了两种不同类型池塘中氮循环细菌和氮移除变化规律。水化指标表明，青饲料塘中氨氮、亚硝态氮和硝氮均显著低于精饲料塘。利用高通量测序技术分析了两种池塘中氮循环相关细菌。结果表明，硝化螺菌属、亚硝化单胞菌属、异养反硝化菌属、部分自养反硝化菌属（副球菌属和硫杆菌属）丰度在精饲料塘中更高，而部分自养反硝化菌属（Dokdonella属和溶杆菌属）丰度在青饲料塘中更高。这些结果表明投喂青饲料池塘可能改变了池塘中氮循环途径，从而改善了池塘水质。
　　3.池塘水体氨氧化细菌季节变化及其与环境影响因子相关性分析
　　以氨氧化细菌(AOB)的氨单加氧酶amoA基因为分子标记，调查了湖北省公安县崇湖渔场草鱼池塘水体AOB季节变化，并分析了AOB丰度与主要环境因子的相关性。结果表明，池塘表、底层水体AOB amoA基因拷贝数均呈相似的季节变动规律，即夏季显著高于春、秋两季，而春、秋两季间无显著差异;相同季节池塘表、底层水体AOB amoA基因拷贝数无显著差异。表、底层水体AOB amoA基因拷贝数均与温度、总磷呈显著正相关;与溶解氧呈显著负相关。此外，表层AOB amoA基因拷贝数与总有机碳呈极显著负相关。主成分分析将8个环境因子划分为三个主成分。表层第一主成分为水温、溶解氧、氨氮与总磷，第二主成分为硝态氮与总有机碳，第三主成分为总氮与亚硝态氮;底层第一主成分为水温、溶解氧、氨氮、总磷与总有机碳，第二主成分为硝态氮与亚硝碳氮，第三主成分为总氮。

目录

声明

摘要

1 文献综述

1．1 微生物在养殖生态系统中的研究概述

1．1．1 微生物生态学研究进展

1．1．2 微生物在养殖生态系统的地位

1．1．3 影响养殖池塘微生物变化的因素

1．2 养殖池塘氮的收支、有害形态及氮循环生化反应及其相关的微生物

1．2．1 养殖池塘氮的收支及有害形态

1．2．2 氮循环生化反应及其相关的微生物

1．3 环境微生物的研究技术

1．3．1 环境微生物定性分析方法

1．3．2 环境微生物定量分析方法

1．4 选题意义及目的

2 两种饲料池塘水体中微生物丰度及群落结构的比较

2．1 材料与方法

2．1．1 实验地点与养殖模式的设定

2．1．2 水样的采集和处理

2．1．3 水样理化指标测定

2．1．4 水样中微生物总DNA提取

2．1．5 细菌16S rRNA的定量

2．1．6 Illumina MiSeq高通量测序

2．2 采用的统计分析软件

2．2．1 水化数据及基因定量结果

2．2．2 微生物多样性及群落结构结果

2．3 结果

2．3．1 投喂两种饲料对池塘水体理化指标的影响

2．3．2 细菌16S rRNA的定量结果

2．3．3 池塘水体细菌丰富度和多样性

2．3．4 样品间venn图比较

2．3．5 水体微生物群落结构变化

2．3．6 水样相似性分析

2．3．7 水体微生物群落结构与环境因子的相关分析

2．4 讨论

2．4．1 投喂不同两种饲料对池塘水质影响

2．4．2 池塘细菌的分布特征

2．4．3 池塘微生物群落分布特征

2．4．4 不同饲料对池塘微生物群落结构的影响

2．4．5 池塘细菌群落分布与理化因子的关系

3 池塘水体氮循环微生物对两种饲料的响应

3．1 材料与方法

3．1．1 实验地点与养殖模式的设定

3．1．2 水样的采集和处理

3．1．3 水样理化指标测定

3．1．4 水样中微生物总DNA提取

3．1．5 Illumina MiSeq高通量测序

3．2 采用的统计分析软件

3．3 结果

3．3．1 池塘水体理化因子

3．3．2 AOB amoA基因定量结果

3．3．3 氮循环相关序列

3．4 讨论

3．4．1 池塘水体氮移除

3．4．2 硝化作用

3．4．3 反硝化作用

3．4．4 厌氧氨氧化作用

4 池塘水体氨氧化细菌季节变化及其与环境影响因子相关性分析

4．1 材料与方法

4．1．1 实验地点与养殖模式的设定

4．1．2 水样的采集和处理

4．1．3 水样理化指标测定

4．1．4 水样中微生物总DNA提取

4．1．5 AOB amoA基因PCR扩增

4．1．6 AOB amoA基因的荧光定量PCR

4．2 数据处理

4．3 结果

4．3．1 池塘水体理化因子

4．3．2 AOB amoA基因丰度

4．3．3 AOB amoA基因丰度与水体理化性质相关性

4．3．4 AOB amoA基因丰度与环境因子的主成分分析

4．4 讨论

参考文献

致谢

文章发表情况