广东及周边省份猪流行性腹泻分子流行病学调查及猪氨基肽酶N多抗的制备

摘要

2010年十月，我国大面积爆发猪流行性腹泻（PED），在短短一年时间内，造成多个省份超过100万头猪死亡，给我国养猪业带来了巨大的经济损失。广东省作为全国养猪大省，在此之后，虽大部分猪场均采用疫苗免疫预防PED，但效果并不理想。
　　本次实验中，采集2015-2016年广东省及周边省份临床表现为腹泻的样品共178份，通过RT-PCR对这些样品进行PEDV、TGEV、RV检测，选取20个PEDV阳性样品，通过RT-PCR扩增毒株的S基因全序列、M基因全序列以及ORF3基因全序列并克隆至载体测序，并与GenBank已经发布的毒株序列比较，分析广东省及周边省份PED流行毒株的遗传进化关系，核苷酸序列及氨基酸序列同源性以及序列位点变化。
　　本实验178份样品中，有137份样品显示PED阳性，6份样品显示TGE阳性，10份样品显示RV阳性，阳性率分别为77.0％、3.4%、5.6%。从结果中可看出，冬季与春季PED的阳性率明显高于其他两季。从S基因遗传进化关系来看，本实验所得20个 PEDV毒株均与中国2010年之后分离毒株 CH/GDZQ/2014与CH/HNLH/2015亲缘关系较近。分析S基因及其编码蛋白序列，与经典毒株CV777比较，有15个碱基插入与6个碱基的缺失，导致N58Q/HGV61和N140氨基酸插入， D164I165氨基酸缺失。比较其四个抗原表位，分别具有10～15个氨基酸的变异。分析M基因遗传进化关系可知，20个样品核苷酸同源性为97.2%～100.0%，氨基酸同源性96.5%～100%，与CV777、83P-5、Br1/87之间的核苷酸同源性为97.5%～99.6%，氨基酸同源性为97.4%～99.1%，说明M基因较为保守。实验中M基因与近年来的流行毒株一样具有3个氨基酸突变。分析20株毒株的ORF3基因可知20个毒株均为675bp，没有缺失，属于流行强毒株。同源性分析表明20个样品之间核苷酸同源性为98.2%～100.0%，氨基酸同源性98.2%～100.0%，同源性较高，与 DR13同源性较高，核苷酸同源性为97.9%～98.4%，氨基酸同源性为98.2%～99.6%。分析其氨基酸序列发现具有8个氨基酸突变，与韩国毒株DR13非常相似。这些结果表明，广东省及其周边省份猪场中普遍存在猪流行性腹泻病毒，其基因也在不断变化。
　　为了进一步了解广东省及其周边省份 PED流行毒株的性质、功能及感染特性，因此需要深入了解作为PEDV受体的猪氨基肽酶N（pAPN）的基本性质，作用方式以及其功能特性，并为后续实验做准备。根据GenBank中登录号为NM_214277的猪氨基肽酶 N序列设计一段引物，扩增其中1176bp，将扩增产物克隆至表达载体 pET-32a中，构建重组质粒pET-32a-APN-C。将重组质粒转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，优化IPTG诱导条件，表达与预期大小相符的约53kDa的蛋白，可溶性分析结果表示其蛋白主要存在于包涵体中。将融合蛋白纯化后，免疫新西兰白兔制备多克隆抗体。3次免疫后心脏采血，通过免疫印迹试验检测其特异性，并用琼脂扩散实验检测其抗体效价，结果表明，抗体与APN-C蛋白结合良好，制备的多克隆抗体效价为1:8。
　　目前市面没有商品化猪APN单抗，因此，猪APN多克隆抗体的制备，为后续研究做好准备，为进一步研究PEDV感染特性及猪流行性腹泻的防治奠定基础。

目录

声明

缩略语表（Abbreviation）

第1章 文献综述

1.1 猪流行性腹泻

1.2 PEDV的病原特性

1.3 PEDV的分子生物学特性

1.4 PEDV受体的研究

1.5 PED的流行病学

1.6 PED的诊断

1.7 PED的预防与控制

1.8 PED疫苗研究进展

1.9 本研究的目的和意义

第2章 广东省及周边省份猪流行性腹泻分子的流行病学调查与分析

2.1 实验材料

2.2 实验方法

2.3 结果与分析

2.4 讨论

第3章 猪氨基肽酶N的原核表达和多抗的制备

3.1 实验材料

3.2 实验方法

3.3 结果与分析

3.4讨论

第4章 结论

参考文献

致谢