Electroacupuncture Attenuates Visceral Hypersensitivity by Suppressing Spinal Par-2 and Cgrp Expressions in Animals with Tnbs-Induced Ileitis

摘要

炎症性肠病(IBDs)是免疫介导的慢性、间歇性复发肠道炎症，主要包括克罗恩病(CD)和溃疡性结肠炎(UC)。内脏超敏反应(VH)，作为IBDs的一个重要的病理生理机制，近几年受到越来越多的关注。在70％IBDs病例的急性期和恢复期，持续释放的炎性介质导致肠壁神经末梢敏感化，并引起腹痛。2/3CD病例表现为回肠末端穿透肠壁性炎症。患回肠炎的CD患者是否遭受内脏敏感困扰似乎存在争议，并且证据缺乏。妥善解决对VH的争议需要选择CD模型进行验证，以增加对该领域的了解。对CD回肠炎的内在超敏机制的理解，可以使用特定的动物回肠CD模型来解决。尽管几种因素，如炎症、心理和肠道异常感觉和运动功能，有助于外周和中枢敏感化，但VH确切机制不完全清楚。细胞膜蛋白激活受体-2（PAR-2）与降钙素基因相关肽（CGRP）共表达在VH形成中的作用，吸引研究者们去扩展该领域里知识。现没有单一的治疗方法能够缓解病人VH。VH治疗方法主要集中在抑制异常黏膜免疫反应方面。这些治疗尽管在一些患者成功，但在大多病例，特别是在炎症消退期，并无明显效果。这样就需要新的治疗方法。针灸是一种传统中医治疗方法，在中国已有几千年的实践经验。与药物疗法相比，电针(EA)安全，且无并发症。虽然电针似乎是胃肠道疾病患者和实验动物VH的一种有前途的治疗方法，但至今没有关于其缓解回肠炎性VH的报道。在EA成为一种治疗VH新方法前，需要科学证据证明它是否通过干预PAR-2和CGRP发挥作用。因此，本研究首先揭示了TNBS诱导的回肠炎中存在VH，然后探讨了在VH过程中电针刺激对脊髓PAR-2调节的CGRP和c-Fos表达干预。
　　1.TNBS通过诱导大鼠回肠炎引发内脏超敏
　　目的:为了研究2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)诱导的大鼠回肠炎中内脏超敏的存在。
　　方法:将雄性SD大鼠麻醉，打开腹腔，分别于回肠注射TNBS（0.6ml，80mg/kg，于30％乙醇中，n=48），等体积的30％乙醇(n=24)和生理盐水(n=24)。分别于第1、3、7、14、21和28天，内脏超敏通过评估大鼠内脏在20、40、60、80和100mmHg结直肠扩张压力(CRD)下的内脏运动反应(VMR)确定。CRD测试后，立即安乐死大鼠，采集终端回肠段样品，采用ELISA法检测MPO和细胞因子（TNF-α，IL-1β，IL-6）含量;脊髓背根神经节(T11)用于免疫组织化学法测定CGRP含量。
　　结果:在各组中，仅TNBS组在第3天开始表现透壁炎症，在7天达到最明显，随后逐渐减退并持续到第21天。回肠炎大鼠在第7天至第21天对CRD出现明显VMR(P＜0.05)，背根神节CGRP免疫反应阳性细胞在第7天至第21天显著增加(P＜0.05)，这与TNBS处理大鼠内脏过敏反应一致。
　　结论和临床关联:TNBS注入回肠诱导透壁回肠炎，包括肉芽肿和内脏过敏。该模型由于模仿了CD的临床表现，可提供探讨肠道炎症和内脏超敏发病机制的思路，并为治疗克罗恩回肠炎提供了治疗方案。
　　2.电针通过对脊髓PAR-2和CGRP激活的干预缓解内脏超敏
　　目的:本研究旨在确认EA刺激后三里(ST-36)穴位对TNBS诱导回肠炎山羊的VH治疗效果，并探讨EA对脊髓PAR-2介导CGRP和c-Fos表达的影响。
　　方法:山羊完全麻醉后，进行右侧剖腹手术。于VH组(n=12)、假针组(n=6)和EA组(n=6)的回肠壁注射30 mg TNBS和30％的乙醇混合物，对照组(n=12)注射等体积0.9％生理盐水。术后第7天，分别从VH组和对照组取6只山羊，行回肠末端切除术，用于病理组织检查和ELISA检测髓过氧化物酶，以评估炎症状态。
　　实验山羊俯卧保定。EA组山羊于第7天电针(60 Hz，3mA，ST-36)30 min，其后每3天电针1次，持续到第22天（共6次）。假针组只插针不通电，保持30 min。对照组和VH组山羊每天同一时间以相同的方式保定30 min，不插针也不通电。每次电针结束后，给予各组山羊结直肠扩张刺激，EMG定量记录其内脏运动反应。最后1次测定后，山羊安乐死，并采取脊髓(T10-L1)，分别采用免疫组化、Western blotting和qPCR检测PAR-2、CGRP和c-Fos表达水平。同时，每头山羊取距近回盲交接处15 cm的6 cm回盲肠段，用于组织病理学检测。
　　结果:TNBS组山羊在7天表现出黏液样便或血性稀便、行动迟缓、体重减轻、回肠组织肉眼和显微病理学积分以及MPO浓度显著增加。显微镜下观察， VH组和假针组山羊在22天可见轻微回肠炎症，而电针组山羊没有回肠炎变化。与VH组相比，EA组山羊对各种CRD刺激表现较低的VMR。电针具有累积效应，电针组山羊在第16天80(P＜0.05)和100 mmHg(P＜0.01)扩张压力下VMR减弱;于第19天和22天，40、60、80和100 mmHg扩张压力下VMR均下降(P＜0.01)。重复电针处理显著抑制脊髓PAR-2、 CGRP和c-Fos表达。
　　结论和临床关联:TNBS注射到回肠透壁，成功诱导了回肠炎。电针通过下调PAR-2，调节在脑-肠轴伤害性刺激的脊髓传输中的CGRP和c-Fos共表达。电针刺激治疗表现了显著的抗超敏效果。重复电针疗法可能有效地治疗IBDs，IBS等功能性肠病引发内脏过敏。

目录

声明

CONTENTS

摘要

Abstract

Abbreviations

Chapter 1．Introduction

1．1 PAR-2 activation in gastrointestinal tract

1．1．2 Effects of PAR-2 on the gastrointestinal tract

1．2 CGRP receptors and their distribution

1．2．1 CGRP modulates the mast cell functions

1．2．3 Role of CGRP in sensitization

1．3 Role of PAR-2 in visceral hypersensitivity

1．4．Role of PAR-2 in pain transmission

1．5 Therapies targeting PAR-2 and CGRP for visceral hypersensitivity

1．6 Objectives of the proposed research

lnnovation

Chapter 2．Visceral hypersensitivity is provoked by TNBS-induced ileitis

2．1 Materials and methods

2．1．1 Experimental animals

2．1．2 Induction of ileitis

2．1．3 Visceromotor response to colorectal distension

2．1．4 Symptoms and disease activity index

2．1．5 Tissue sampling

2．1．6 Macroscopic and microscopic observation

2．1．7 CGRP immunohistochemistry in DRG

2．1．9 Statistical analysis

2．2 Results

2．2．2 Macroscopic scoring of ileitis

2．2．3 Microscopic scoring of ileitis

2．2．4 Expression levels of CGRP in the DRG

2．2．5 Concentrations of MPO and cytokines

2．2．6 Visceromotor response to colorectal distension

2．2．7 Correlation between total VMR and CGRP level

2．3 Discussion

Chapter 3．Electroacupuncture intervention of visceral hypersensitivity is involved in activation of PAR-2 and CGRP in the spinal cord

3．1 Materials and Methods

3．1．1 Animal grouping

3．1．2 Visceral hypersensitivity model

3．1．3 Assessment of ileal inflammation

3．1．4 Electroacupuncture

3．1．5 Visceromotor response to graded colorectal distension

3．1．6 Tissue preparation

3．1．7 Immunohistochemistry

3．1．8 Western blotting analysis

3．1．9 RNA extraction and real-time quantitative PCR

3．1．10 Statistical analysis

3．2 Results

3．2．1 Ileal inflammation

3．2．2 Cumulative effects of repetitive EA intervention on VMR to CRD

3．2．3 Effects of repetitive EA intervention on distribution PAR-2，CGRP and c-Fos immunonoreactivities

3．2．4 Effcts of repetitive EA intervention on measurement of PAl02，CGRt and c-Fos proteins

3．3 Discussion

4 Conclusions

References

Acknowledgements

Dedications

Appendix