CUMULATIVE EFFECT OF ELECTRO-ACUPUNCTURE ON VISCERAL PAIN AND SPINAL p38MAPK AND C-FOS EXPRESSION IN GOATS WITH VISCERAL HYPERSENSITIVITY

摘要

内脏超敏(VH)是人和动物胃肠道疾病的一个重要特征。它通常是指内脏痛觉过敏（对伤害性刺激的反应增强），或/和触敏痛（对非伤害性刺激产生疼痛反应），并伴有肠道运动改变以及肠黏液分泌物增加。内脏疼痛常伴随内脏超敏发生。VH或者内脏疼痛对日常生活有相当大的负面影响，会造成巨大的经济负担，并且对全球医疗体系带来巨大的压力。相对于其它肠段，小肠长度更长并且蠕动性更强，所以更容易发生炎性疾病，引起内脏疼痛和痛觉过敏。在肠道，小肠是临床疾病最易发生的部位。VH因病理发生尚不完全清楚，其治疗仍是个难题。多数研究采用结肠炎模型研究VH。然而，这个模型不适合研究小肠炎症（例如回肠炎）诱发VH的确切机制，因为它的位置，持续时间和中枢调节机制都不相同。因此，需要采用动物小肠炎性模型来研究小肠炎症诱发VH和疼痛的机制，并评估其治疗效果。
　　越来越多的证据表明p38MAPK信号通路在介导炎症、疼痛的形成和维持方面有重要作用。然而，尚不清楚脊髓p38MAPK信号通路的激活是否可以促进VH的形成。目前临床上治疗疼痛管理主要包括几类药物的组合应用，例如阿片类药物、抗抑郁药、抗痉挛/抗惊厥药、或非甾体类抗炎药。长期服用这些药物有明显的副作用，包括镇痛不全、上瘾、耐受、疲劳以及肠胃功能和心血管毒性。探索一种安全、有效的抗炎和镇痛的治疗方案和低风险的补充疗法非常必要。针灸，古代的中国艺术，在各种疼痛疾病治疗方面应用了3000多年。现在，电针(EA)是将电流通过针刺针应用到穴位，使针灸具有高疗效、低风险的特征，因此而风靡全球。c-Fos被认为是神经元激活的标志，因此被用于标记中枢神经系统与外周感受相关的神经元激活。一些研究表明，电针对内脏痛和VH有效。其他一些研究表明可以通过下调p38MAPK抑制炎症和神经性疼痛。然而，EA是否可以通过调节p38MAPK来改变内脏痛或VH尚不清楚。本实验采用TNBS诱导回肠炎，并采用行为变化评分评估山羊内脏疼痛强度。在此基础上，对回肠炎山羊进行连续电针，研究EA的累积镇痛效果，以及EA对脊髓p38MAPK和c-Fos蛋白表达的影响。
　　1.通过牵引回肠炎山羊的回盲肠韧带触发内脏痛
　　目的:通过牵引TNBS诱导的回肠炎山羊的回盲肠韧带来量化内脏痛的强度。
　　方法:36头雄性山羊，体重为20.05±2.1kg，随机平均分成TNBS组(18头)和生理盐水对照组（18头）。将30mg的2，4，6-三硝基苯磺酸（TNBS）溶解于30％的乙醇，通过开腹手术注射到回肠壁建立回肠炎模型。于对照组山羊，将等量的生理盐水替代TNBS溶液，注射到回肠壁上。于3、7和14天观察牵拉回盲肠韧带（2、4和6牛顿）引起的行为反应。于第3、7和14天行为测试后，随即每组取6头山羊，进行开腹手术，切除部分回肠。评估回肠病理组织变化，并用ELISA检测过氧化物酶、IL-1β、IL-6和TNF-α的浓度。
　　结果:与生理盐水对照组相比，TNBS组山羊，在第3天和第7天眼观病理变化积分、肥大细胞计数、髓过氧化物酶和肿瘤坏死因子浓度均显著增加，第3天到第14天显微病理学变化积分、白介素-1β以及白介素6浓度均增加。TNBS组山羊行为变化随着牵引力增加而明显，并与显微病理学变化及细胞因子水平变化一致。因此，牵引力与疼痛行为反应呈正相关。
　　结论:在回肠炎山羊回盲肠韧带施加牵引力，引起了显著、稳定和可重现的回肠源性疼痛。该模型有助于评估新药控制内脏痛的效果，并研究其机理。
　　2.电针累计效应对p38MAPK和c-Fos在内脏超敏山羊脊髓背角表达的影响
　　目的:研究多次电针对山羊回肠炎诱导的内脏超敏及脊髓p38MAPK和c-Fos激活的影响。
　　方法:30只试验山羊被随机分成:生理盐水组(n=9)、假针组(n=6)、2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)组(n=9)和TNBS+EA组(n=6)。经开腹暴露山羊回肠，于假针组、TNBS组及TNBS+EA组山羊回肠壁注射TNBS溶液(30mgTNBS溶解于1.2mL40％乙醇中)诱导内脏痛。生理盐水组山羊以同样的方式注射等体积生理盐水以替代TNBS溶液。于第7天，取Saline组和TNBS组山羊3只，经剖腹暴露回肠，切除部分肠道以评估炎症。于7、10、13、16、19和22天应用电针双侧“足三里”穴(ST36)30min（连续波60Hz，强度3mA）。以内脏运动对结直肠扩张(CRD)刺激（强度20、40、60、80和100mmHg），采用肌电图(EMG)记录内脏运动反应（VMR），评估内脏超敏。于第22天，试验山羊施实安乐死，采用western blotting检测第11胸椎脊髓段(T11) p38和c-Fos蛋白表达，RT-qPCR检测p38和c-Fos的mRNA水平。同时，每头山羊取距近回盲交接处15cm的6cm回盲肠段，用于组织病理学检测。一
　　结果:实验结果表明与对照组相比TNBS组的VMR显著升高(P＜0.01)，并且脊髓p38MAPK和c-Fos蛋白和基因表达也显著性升高(P＜0.01)。相比之下，TNBS+EA组的山羊在20、40、60、80和100mmHg的CRD刺激下VMR显著降低。双侧足三里穴位重复EA可以降低山羊回肠壁注射TNBS诱导的机械超敏。结果表明，与TNBS组比，TNBS+EA组经连续EA治疗6次后可以显著抑制(P＜0.05)脊髓p38MAPK和c-Fos蛋白和基因表达(P＜0.01)，回肠微观病理学积分显著降低。
　　结论:试验结果表明内脏超敏的山羊可能跟脊髓磷酸化p38和c-Fos蛋白表达受抑制和基因表达有关。磷酸化p38 MAPKs可能部分参与了EA镇痛效果的调控机制。因而，EA是治疗和缓解内脏超敏的潜在治疗手段。

目录

论文说明

声明

TABLE OF CONTENTS

摘要

Abstract

LIST OF ABBREVIATIONS

CHAPTER-1 GENERAL INTRODUCTION

1．1 Overview of visceral pain

1．2 Role of cytokines in pain

1．3 Mast cells and pain

1．4 MAPKs and Pain

1．5 p38MAPK and pain

1．6 Electro-acupuncture

1．7 Objectives of the proposed research

CHAPTER 2 Visceral pain triggered by traction on the ileocecal ligament with ileitis

2．1 Materials and methods

2．1．1 Experimental animal and grouping

2．1．2 Induction of experimental ileitis

2．1．3 The observation of pain behavioral responses

2．1．4 Sample collection

2．1．5 Macroscopic and microscopic observations of ileal tissue

2．1．6 Measurement of cytokines and myeloperoxidase

2．1．7 Statistical analysis

2．2 Results

2．2．1 Behavioral responses to traction on ileocecal ligament

2．2．2 Percentage body weight changes in treated goats

2．2．3 Ileal macroscopic features of treated goats

2．2．4 Ileal microscopic changes in experimental goats

2．2．5 Changes in ileal eytokines and myeloperoxidase concentrations

2．3 Discussion

Chapter 3 Cumulative effect of electroacupuncture on p-p38MAPK and c-Fos expression in the spinal dorsal horn of goats with visceral hypersensitivity

3．1 MATERIALS AND METHODS

3．1．1 Experimental Animal and Grouping

3．1．2 Animal model of visceral hypersensitivity

3．1．3 Ileal sample collection

3．1．4 Microscopic observations

3．1．5 Electroacupuncture stimulation

3．1．6 Recording of visceromotor response to colorectal distension

3．1．7 Immunohistochemistry

3．1．8 Western blotting

3．1．9 RT-PCR

3．1．10 Statistical Analysis

3．2 Results

3．2．1 Microscopic scoring of ileitis in experimental goats

3．2．2 Cumulative effect of electroacupuncture on microscopic changes in goats

3．2．3 Effect of electroacupuncture on visceromotor response in goats

3．2．4 Cumulative effect of electroacupuncture on spinal p38MAPK-IR cells and c-Fos-IR cells in goats with TNBS-induced ileitis

3．2．5 Cumulative EA treatments suppress spinal p38MAPK and c-Fos protein expression in TNBS-induced ileitis goats

3．3 Discussion

Chapter 4

4．1 Conclusions

4．1．1 experiment-1

4．1．2 experiment-2

References

ACKNOWLEDGEMENTS

Dedication

Curriculum Vitae

List of Original Publications

Appendix