猪P58IPK通过PERK/eIF2α通路调控PCV2诱导的细胞自噬的研究

摘要

猪圆环病毒2型(PCV2)感染抑制猪免疫反应，并伴随与其他病原体混合感染，严重危害养猪业。PCV2感染诱导细胞自噬和内质网应激，并通过PERK/eIF2α通路诱导未折叠蛋白反应(UPR)，且细胞自噬和PERK/eIF2α通路的激活都有利于病毒增殖。近年来部分研究表明，UPR也参与细胞自噬的调控，然而PCV2感染是否通过PERK/eIF2α通路诱导细胞自噬还有待研究。此外，分子伴侣蛋白P58IPK可抑制PERK活性，负反馈调节PERK/eIF2α通路，且是PCV2衣壳蛋白(Cap)的潜在互作蛋白。鉴于此，本研究以宿主的UPR为切入点，探讨猪分子伴侣蛋白P58IPK对PCV2诱导的细胞自噬的作用与机理。主要的研究结果如下:
　　1.PCV2感染通过PERK/eIF2α通路调控细胞自噬
　　利用PERK特异性抑制剂和siRNA分别干扰PERK通路，PCV2感染24h后的ATG5-ATG12(0.32 vs0.25，P＜0.0001)及LC3-Ⅱ（0.23 vs0.07，P＜0.0001）的水平显著下调。说明PCV2感染通过PERK/eIF2α通路调控自噬水平。
　　2.P58IPK通过PERK/eIF2α通路调控PCV2感染所诱导的细胞自噬
　　分子伴侣蛋白P58IPK可抑制PERK活性，通过定量PCR检测证实PCV2感染24h时P58IPK mRNA表达显著升高（1.00 vs1.62，P＜0.0001），然而在12、48和72h时P58IPK mRNA表达低于对照。该结果表明在PCV2感染24h前后P58IPK表达受到抑制。
　　过表达P58IPK显著下调PCV2感染24h后所诱导的p-eIF2α(0.051 vs0.037，P＜0.0001),ATG5-ATG12(0.07 vs0.03,P＜0.0001)及LC3-Ⅱ(0.30 vs0.14,P＜0.0001)的表达。说明过表达P58IPK可能通过抑制PERK活性进而下调PCV2感染诱导的自噬。
　　综上所述，本研究不仅验证了PCV2感染诱导内质网应激、未折叠蛋白反应和细胞自噬，还阐明了PCV2感染通过PERK/eIF2α通路诱导细胞自噬，而过表达P58IPK可通过抑制PERK活性以抑制PCV2感染所诱导的自噬。该研究结果将为挖掘调控PCV2感染增殖的宿主（猪）基因提供参考，为研究病毒与宿主间的互作机理打下基础。

目录

声明

论文说明

摘要

缩略语表

1 文献综述

1．1．1 内质网与内质网应激

1．1．2 未折叠蛋白反应的分子机制

1．1．3 内质网分子伴侣蛋白

1．1．4 内质网应激与病毒感染

1．2 P58IPK／DNAJC3

1．2．1 P58IPK的结构与功能

1．2．2 P58IPK与未折叠蛋白反应

1．2．3 P58IPK与病毒感染

1．3 细胞自噬

1．3．1 细胞自噬的分类和生物学功能

1．3．2 细胞自噬的信号调节

1．3．3 细胞自噬与病毒感染

1．4 内质网应激与细胞自噬概述

1．4．1 未折叠蛋白反应与细胞自噬

1．4．2 Ca2+信号通路介导的自噬

1．4．3 内质网应激经由Bcl-2家族蛋白调节自噬

1．5 猪圆环病毒2型(PCV2)研究进展

1．5．1 PCV2感染与内质网应激

1．5．2 PCV2感染与分子伴侣蛋白

1．5．3 PCV2感染与细胞自噬

2 研究目的与意义

3 材料与方法

3．1 实验材料

3．1．1 细胞、毒株、菌株

3．1．2 载体与质粒

3．1．3 工具酶与主要试剂

3．1．4 抗体、siRNA及主要化学试剂

3．1．5 培养基与抗生素及其配制

3．1．6 主要缓冲液与相关试剂及其配制

3．1．7 主要实验仪器及设备

3．1．8 分子生物学分析软件

3．2 实验方法

3．2．2 病毒扩繁与感染

3．2．3 真核过表达质粒的构建

3．2．4 药物处理

3．2．5 免疫印迹

3．2．6 siRNA及质粒转染

3．2．7 实时荧光定量PCR

3．2．8 统计学方法

4 结果与分析

4．1．2 PCV2感染PK15细胞激活PERK／eIF2α通路

4．1．3 PCV2感染PK15细胞后期P58IPK表达下调

4．1．4 PCV2感染PK15细胞不依赖caspase-12途径介导的凋亡

4．2 PCV2感染诱导细胞自噬

4．2．1 PCV2感染PK15细胞上调Beclin1及LC3-Ⅱ蛋白表达

4．2．2 PCV2感染PK15细胞下调p62蛋白表达

4．3．1 PERK抑制剂(GSK2606414)下调PCV2诱导的p-eIF2α及LC3-Ⅱ蛋白表达

4．3．2 siRNA干扰PERK下调PCV2诱导的p-eIF2α、ATG5-ATG12、LC3-Ⅱ蛋白表达

4．3．3 siRNA干扰PERK下调PCV2诱导的CHOP蛋白表达

4．4 过表达P58IPK抑制PCV2感染诱导的细胞自噬

4．4．1 猪P58IPK真核过表达载体的构建

4．4．2 过表达P58IPK下调PCV2诱导的p-eIF2α蛋白表达

4．4．3 过表达P58IPK下调PCV2诱导的ATG5-ATG12及LC3-Ⅱ蛋白表达

5 讨论

5．1 PCV2感染诱导内质网应激

5．2 PCV2感染激活PERK／eIF2α通路

5．3 PCV2感染后期抑制P58IPK表达

5．4 PCV2感染通过激活PERK／eIF2α通路诱导细胞自噬

5．5 过表达P58IPK抑制PCV2感染诱导的细胞自噬

6 小结

6．1 结论

6．2 研究特色与创新

6．3 进一步研究内容

参考文献

致谢