陆地棉体细胞胚胎发生过程中miRNAs及其靶标的鉴定和GhmiR157a/GhSPL10功能分析

摘要

体细胞胚胎发生体系是研究已分化组织和器官脱分化和再分化的良好模型，也是植物转基因技术的重要依托，对于其机制的研究具有重要的理论和应用价值。microRNAs(miRNAs)是一类长度通常为19-25个核苷酸(nt)的内源非编码RNA，在植物的生长发育，激素信号转导，逆境胁迫响应等方面起着重要的作用。然而棉花中关于miRNAs的研究较少;本研究基于实验室前期筛选的一个高效体细胞胚胎发生的材料YZ1，利用小RNA测序结合降解组测序，鉴定棉花体细胞胚胎发生过程中的小RNA及其靶标基因，研究他们在体细胞胚胎发生过程中的动态调控，综合阐述小RNA及其靶标基因在棉花体细胞胚胎发生中的调控作用;并进一步探讨棉花中GhmiR157a及其靶标GhSPL10在棉花脱分化过程中的生物学功能。主要研究结果如下:
　　1、棉花体细胞胚胎发生相关miRNAs及其靶标基因的挖掘与鉴定
　　本研究构建了YZ1胚性愈伤(EC)和下胚轴(CK，对照)的小RNA测序文库。发现36个家族的保守miRNAs在两个样品间差异表达，发现属于19个家族的29条保守miRNAs的前体，同时发现了25个新的miRNAs及其前体。这些miRNAs的长度主要集中在19nt到24 nt之间，21 nt的占了约80％。同时利用降解组测序，在EC中共发现234个转录本被23个保守miRNAs家族成员所剪切，在CK中共发现322个转录本被30个保守miRNAs家族成员所剪切，同时发现16个转录本被8个新的miRNAs所剪切。这些保守靶标中包括转录因子、激素信号以及逆境信号相关的基因。此外本研究还发现4个TAS3转录本产生的tasiRNAs及其靶标AFR3/4。5'RACE技术证实大部分保守miRNA能够诱导它们保守的靶标转录本被剪切降解，这说明降解组测序的结果是比较可靠的。miRNA和靶标表达模式分析发现，miR156及其靶标SPL9，miR169及其靶标NF-YA3和miR396及其靶标GRF8在棉花体细胞胚胎发生过程中具有明显的负相关性，据此推测这些miRNAs可能通过负调控相应的靶标进一步调控下游信号路径，从而参与调控陆地棉体细胞胚胎发生过程。
　　2、GhmiR157a/GhSPL10参与调控棉花体细胞胚胎发生过程
　　体细胞胚胎发生过程中的表达分析发现GhmiR157a及其靶标GhSPL10在脱分化前期以及胚性再分化过程中均显示相反的表达趋势。进一步通过原位杂交发现GhSPL10在外植体的形成层以及鱼雷胚的原维管组织表达，暗示GhmiR157a和 GhSPL10可能通过调控形成层细胞分裂和分化来调控体细胞胚胎发生过程。通过转基因手段超表达GhmiR157a和GhSPL10，发现虽然超表达GhmiR157a没有明显表型，但是超表达GhSPL10能够提高愈伤增殖速率(callus proliferation rate，CPR)，并且导致胚性再分化提前。转基因系脱分化前期的石蜡切片显示GhSPL10超表达造成维管束形态发生了变化，表现为木质部细胞小而多，且连续分布;外植体诱导3d以后形成层细胞增多，并且细胞周期相关基因上调表达。这些结果说明GhSPL10超量表达造成了形成层细胞分裂加快，从而提高了脱分化速率。
　　3、GhmiR157a/GhSPL10通过调控乙烯信号路径和类黄酮生物合成路径来调控棉花体细胞胚胎发生
　　为了进一步阐释超表达GhSPL10脱分化加快的原因，本研究对阴性对照和GhSPL10超量表达株系35S∶rSPL10-7的下胚轴进行RNA-SEQ测序。通过对测序结果分析发现:1）GhSPL10超表达系与对照相比，有1600多个差异表达的基因，其中1005个上调表达，633个下调表达;2）利用差异表达的基因进行GO和KEGG分析均发现类黄酮生物合成路径和植物激素信号路径显著富集;3）qRT-PCR验证了乙烯合成酶基因ACOs以及类黄酮合成相关基因在GhSPL10超表达系中均上调表达;4）类黄酮含量测定发现GhSPL10超表达系中不同种类的类黄酮与对照相比显著增加。
　　35S∶rSPL10-7与F3H干涉系Ri3杂交F1代愈伤增殖明显受抑制，并且在体外添加类黄酮之后恢复至野生型水平。对野生型外植体进行不同种类的类黄酮处理也能够促进愈伤增殖和细胞周期相关基因的表达。以上结果说明类黄酮在GhSPL10超表达系中的过量积累是造成其愈伤增殖变快的主要原因。
　　4、乙烯信号是导致类黄酮生物合成路径上调的主要因素之一。
　　用乙烯合成抑制剂AVG处理35S∶rSPL10-7外植体明显抑制其脱分化，而用乙烯前体ACC处理野生型外植体能够促进愈伤增殖，用乙烯合成的抑制剂AVG和CoCl2，或者乙烯响应的抑制剂Ag2S2SO3处理则抑制脱分化，说明乙烯信号在GhSPL10超表达系中的上调对愈伤增殖起到正向作用。另外，qRT-PCR的结果显示，ACC处理能够进一步激活35S∶rSPL10-7中F3H的相对表达水平，而在rSPL10-7/F3H-Ri3外植体中F3H表达受到明显抑制，且ACC处理并不能进一步上调其表达水平，说明GhSPL10超表达确实造成了乙烯介导的类黄酮生物合成路径的变化。另外在脱分化前期，通过ACC处理野生型或者超表达EIN2和干涉CTR1都能够造成类黄酮合成相关基因和类黄酮含量的增加，而Ag2S2SO3处理则在一定程度上降低类黄酮合成相关基因和类黄酮含量，说明乙烯信号的上调是导致GhSPL10超表达系中类黄酮过量积累的因素之一。除了乙烯，生长素处理也能够促进脱分化前期类黄酮合成相关基因的表达。

目录

声明

摘要

缩略语表

第一章 文献综述

1．1 植物体细胞再生研究进展

1．1．1 植物体细胞再生简介

1．1．2 植物再生的分子机制

1．1．3 棉花体细胞胚胎发生研究进展

1．2 植物microRNAs的研究进展

1．2．1 植物miRNAs的动态合成

1．2．2 植物miRNAs的调控机理

1．2．3 MIR基因的进化

1．2．4 植物miRNAs的生物学功能

1．2．5 植物小RNA及其靶标的研究方法

1．3 miR156及其靶标基因功能研究进展

1．3．1 miR156／SPLs调控发育转换和开花

1．3．2 miR156／SPLs调控生殖器官和果实发育，以及谷物产量

1．3．3 miR156／SPLs调控叶片异质性

1．3．4 miR156／SPLs调控表皮毛和侧根发生

1．3．5 miR156／SPLs参与调控次级代谢物的生物合成和逆境响应

1．3．6 miR156／SPLs参与植物再生调控

1．4 本研究的目的和意义

第二章 棉花体细胞胚胎发生相关miRNAs及靶标的鉴定与分析

2．1 实验材料和方法

2．1．1 实验材料

2．1．2 实验方法

2．2 实验结果与分析

2．2．1 小RNA的注释与序列特性分析

2．2．2 保守和新miRNAs的鉴定

2．2．3 miRNAs在棉花体细胞胚胎发生过程中的表达模式分析

2．2．4 miRNA靶标的鉴定

2．2．5 tas3-siRNAs及其靶标的鉴定

2．2．6 小RNA靶标的5’ RACE验证

2．2．7 靶标的表达模式分析

2．2．8 靶标与对应miRNAs的表达模式负相关性分析

2．3 讨论

第三章 GhmiR157a／GhSPL1D在棉花体细胞胚胎发生中的功能分析

3．1 实验材料和方法

3．1．1 实验材料

3．1．2 实验方法

3．2 实验结果与分析

3．2．1 靶标SPLs的进化树和保守结构域分析

3．2．2 GhmiR157a和靶标GhSPL1D在棉花体细胞胚胎发生过程中的表达模式分析

3．2．3 GhmiR157a和GhSPL10超表达影响幼苗生长、愈伤增殖和胚性再分化

3．2．4 RNA seqencing分析GhSPL10超表达系中差异表达基因涉及的信号路径的变化

3．2．5 类黄酮的过量积累部分解释了GhSPL10超表达系中幼苗表型和愈伤增殖表型

3．2．6 乙烯信号的增强部分造成GhSPL10超表达系中类黄酮的过量积累

3．3 讨论

3．3．1 GhSPL10超表达导致多个非靶标SPLs的协同上调表达

3．3．2 类黄酮积累影响愈伤增殖，并且可能是导致GhSPL10超表达系胚性再分化提前的原因

3．3．3 乙烯信号路径对愈伤起始和增殖起到决定性的作用

3．3．4 GhSPL10超表达系中乙烯介导的类黄酮生物合成的增加是造成愈伤增殖变快的主要原因

参考文献

附录

在读期间研究成果

致谢