赤点石斑神经坏死病毒感染GF-1和SSN-1细胞的microRNA组与转录组研究

摘要

鱼类神经坏死病毒(Nervous necrosis virus，NNV)也称为β野田病毒(betanodavirus)，是野田病毒(Nodaviridae)家族的一员。NNV感染导致的疾病称为病毒性神经坏死症(viral nervous necrosis，VNN)或者病毒性脑病和视网膜病(viralencephalopathy and retinopathy, VER)，最初分离自患病的海洋鱼类，现在已在120多种不同的养殖和野生鱼类中被报道，严重危害着水产养殖业。近年来，越来越多的证据表明NNV开始在淡水鱼类中流行，感染实验也表明很多淡水鱼类容易受到NNV感染。虽然各国学者在NNV感染的预防和治疗方面投入了大量的研究，但对NNV致病的分子机制还没有完全阐明。通过研究赤点石斑神经坏死病毒(Red-spotted grouper nervous necrosis virus，RGNNV)感染敏感细胞系的microRNA(miRNA)表达谱和转录组测序，可以获得大量RGNNV和宿主相互作用的信息，这些结果将有助于了解RGNNV的复制和致病机制，进而为VER的综合防控提供新的策略。虽然目前已经建立了一些对NNV敏感的细胞系，但来自鱼类神经组织的敏感细胞系还很少，因此，寻找来自鱼类神经组织的NNV敏感细胞系是十分必要的。
　　本研究首先以斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)鳍条细胞系(Grouper fin cells，GF-1)为对象，利用RNA-Seq技术(Illumina)测定了GF-1细胞在RGNNV感染后3和24小时(hour,h)的miRNA表达谱。随后分别研究了GF-1细胞和来自纹月鳢(Channa striatus)鱼苗的SSN-1细胞(striped snakehead fish cells)在RGNNV感染后3和24 h的转录组，在转录组分析的基础上，进一步对NNV感染导致的细胞凋亡途径进行分析，并对两个转录组进行了比较研究。我们还采用鳜脑细胞(Chineseperch brain，CPB)，研究了CPB对RGNNV的敏感性，并在此基础上研究了鳜对RGNNV的敏感性。研究结果如下:
　　1.通过solexa深度测序研究RGNNV感染后GF-1细胞的miRNA表达谱，利用miRDeep2 v2.0.5软件将测序结果与斑马鱼基因组比对，一共鉴定出了220种已知miRNA，预测了18种新的miRNA。利用IDEG6软件，分别在RGNNV感染后3和24 h的GF-1细胞中鉴定到了51和16种差异表达的miRNA(Differentiallyexpressed miRNA，DE-miRNA);对DE-miRNA的靶基因进行预测、功能注释及分析，这些靶基因与广泛的生理调控有关，如转录调控、氧化还原、蛋白水解、细胞凋亡和免疫应答等。通过随机挑选了6个新预测的miRNA进行RT-PCR验证，结果表明这些新的miRNA在GF-1细胞中能够表达。通过随机挑选了6个DE-miRNA进行qRT-PCR验证，这些DE-miRNA的表达趋势与测序结果一致，表明miRNA组测序结果可信;验证了4个DE-miRNA(miR-1，-30b，-150，-184)对RGNNV复制的影响，qRT-PCR和Western blot表明过表达这四种miRNA可以显著地促进RGNNV在GF-1细胞中的复制。
　　2.通过HiSeq2500测序，一共从四个GF-1细胞样品中获得127，259，258 cleanreads，经De novo拼接一共获得了111，860条平均长度为624 bp的unigene;通过blast比对，一共有35，390 unigene(31.64％)得到注释。差异表达基因(Differentiallyexpressed gene，DEG)筛选表明，感染后3和24 h分别有226和117个DEG。进一步对凋亡通路的DEG进行分析，推测RGNNV诱导GF-1细胞的凋亡可以通过线粒体凋亡途径中的Bax和Drp1蛋白来进行;对5个随机挑选的DEG的进行qRT-PCR验证，结果与HiSeq2500测序的结果一致，证实转录组结果是可信的;通过发光法检测Caspase-3，-8和-9的活性，结果表明RGNNV感染可以导致GF-1细胞中Caspase-3，-8，-9活性的显著升高。
　　3.经HiSeq2000测序，一共从四个SSN-1细胞样品中获得253，338，544 cleanreads，经De novo拼接一共获得了93，372条平均长度为829 bp的unigene。通过blast比对，一共有18，974 unigene(20.32％)得到注释。DEG筛选表明，感染后3和24 h分别有2，640和3，211个DEG;对凋亡通路的DEG进行分析，结果表明RGNNV诱导SSN-1细胞的凋亡可以通过线粒体凋亡途径中的EndoG蛋白来进行;对7个随机挑选的DEG的进行qRT-PCR验证，与转录组测定的结果相符，表明测序结果是可信的;通过Annexin V-FITC/PI和DAPI染色，证实RGNNV感染或过表达EndoG可以导致SSN-1细胞的凋亡。
　　4.比较RGNNV诱导GF-1和SSN-1细胞凋亡的途径，在RGNNV感染GF-1和SSN-1细胞的转录组研究中，外源性凋亡途径相关基因的表达都没有发生显著的上调。在内源性凋亡途径方面，RGNNV感染后GF-1细胞中Bax以及Drp1的表达水平显著升高，而SSN-1细胞在RGNNV感染后，EndoG的表达水平显著升高，这三种蛋白都参与线粒体介导的细胞凋亡。此外，在内质网(Endoplasmic reticulum，ER)应激反应方面，RGNNV感染后，Bip的表达水平在GF-1和SSN-1细胞中都发生了显著上调，最终导致线粒体介导的细胞凋亡。由此我们推测RGNNV感染可以通过线粒体和内质网介导的凋亡途径来诱导细胞凋亡，具体的机制还需要进一步研究。
　　5.评估了来自淡水鱼类鳜脑组织的细胞系CPB对RGNNV的敏感性。qRT-PCR检测表明RGNNV在CPB细胞中可以良好地复制。Annexin V-FITC/PI和DAPI两种染色途径证实RGNNV感染可以导致CPB细胞的凋亡。进一步评估鳜对RGNNV的敏感性，通过眼球注射，RGNNV可以感染鳜并导致鳜出现神经症状，表现为游泳异常;对鳜脑组织进行苏木精-伊红(Hematoxylin-eosin，HE)染色观察，感染的鳜脑组织出现大量的细胞空泡化;电镜(electronic microscope，EM)扫描发现在感染的鳜脑组织里有大量紧密排列的病毒粒子，并且大量线粒体出现了肿胀，这一现象与线粒体膜电位损失是否有关还需要进一步的研究。对RGNNV敏感的淡水鱼类脑细胞株CPB的发现，将为RGNNV的致病性研究提供有力的工具。