一种赤点石斑鱼神经坏死病毒检测用引物组、检测方法和快速诊断试剂盒

摘要

本发明公开一种赤点石斑鱼神经坏死病毒检测用引物组、检测方法和快速诊断试剂盒，该引物组由如下四条引物组成：内引物FIP、内引物BIP、外引物F3和外引物B3。本发明的引物组和试剂盒均可高效高特异性地检测赤点石斑鱼神经坏死病毒，它们均是基于环介导等温扩增技术，应用六个区段，四条引物，一个恒定温度，在不到1小时即可完成扩增反应，检测成本低、耗时短、产率高，特异性高，且阴阳性结果显色差异显著，验证率高，更加明显可靠。本发明的试剂盒建立了一套经过优化的反转录-环介导等温扩增反应体系，可用于鱼类养殖过程中各时期的赤点石斑鱼神经坏死病毒跟踪检测，避免病毒传播流行，提高科学管理效率，具有很高的实用价值。

说明书

技术领域

本发明涉及水生生物病害的生物学鉴定，尤其涉及鱼类病毒性神经坏死病的检测，具体涉及一种赤点石斑鱼神经坏死病毒检测用引物组、检测方法和快速诊断试剂盒。

背景技术

鱼类病毒性神经坏死病又称病毒性脑病和视网膜病，是世界范围内的一种鱼类流行性传染病。病原是鱼类神经坏死病毒，属于野田村病毒科II型野田村病毒属。鱼类神经坏死病毒分为4种基因型：分别为红鳍东方鲀神经坏死病毒(tiger puffer NNV，TPNNV)、黄带鲹神经坏死病毒(striped jack NNV，SJNNV)、条斑星鲽神经坏死病毒(barfin flouder NNV，BFNNV)和赤点石斑鱼神经坏死病毒(red-spotted grouper NNV，RGNNV)。

在中国发现的鱼类病毒性神经坏死症的病原主要是赤点石斑鱼神经坏死病毒。鱼类神经坏死病毒对仔鱼和幼鱼危害很大，感染后死亡率极高，各种鱼类感染NNV后的发病时间及死亡率各不相同，最早发病时间是孵化后1d，一般是孵化后1-3周开始发病，严重者在一周内死亡率可达100％。受NNV感染的鱼包括鳗鲡目、鳕形目、鲈形目、鲽形目和鲀形目5个目17科的40多种鱼类。到目前为止，对于病毒性神经坏死病还没有有效的治疗方法，防止病毒的传染和流行是能够采取的主要措施，早期快速诊断神经坏死病毒是减少损失的有效途径，因此，简便快速、特异性好、灵敏度高的诊断试剂盒及其检测方法对于疾病的预防意义重大。

目前常用的检测技术是以聚合酶链式反应(PCR)技术为代表的病原核酸检测技术，但是这些检测技术在实际应用中存在一些问题，如普通聚合酶链式反应(PCR)技术需要专门的仪器，而且存在容易交叉污染和操作过程烦琐的缺点；荧光实时定量聚合酶链式反应技术虽然较好地解决了交叉污染的问题，并简化了操作过程，但却需要更复杂的定量测定仪器，不适用于现场快速检测，而且实时定量聚合酶链式反应PCR技术中荧光探针的成本较高，加大了推广应用的难度；免疫学检测技术快速简便成本低廉，但要求高质量高稳定性的单克隆抗体，否则因准确性不够，目前只能是辅助检测手段。所以及时运用生物技术发展的最新成果对满足病原微生物检测要求的不断提高具有重要意义。

环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification，简称LAMP技术)，是近年来新出现的一种体外扩增特异DNA片段的技术，具有快速、敏感、特异性强等特点，LAMP主要是利用4种不同的特异性引物(引物F3、引物B3、引物FIP和引物BIP)识别靶基因的6个特定区段，在聚合酶和等温条件下高效、快速、高特异地扩增靶序列，扩增反应结束后，通常是采用染色剂对反应产物进行分析。LAMP中所用到的聚合酶通常都选用具有链置换特性的DNA聚合酶，如Bst DNA聚合酶。对LAMP来说，4种特异性引物的设计是其关键所在。

LAMP因其自身的优点，现已被用于病原微生物的检测和传染性疾病的诊断，如：严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)的检测、分支杆菌属检测、腺病毒性结膜炎检测、真菌检测等，现尚未见有将LAMP用于赤点石斑鱼神经坏死病毒检测的相关报道。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种对赤点石斑鱼神经坏死病毒具有高特异性，可用于环介导等温扩增技术检测赤点石斑鱼神经坏死病毒的引物组。

本发明的另一个目的在于提供一种用上述引物组对赤点石斑鱼神经坏死病毒进行快速、高效、高特异性检测的方法。

本发明的另一个目的在于提供含有上述引物组的快速诊断试剂盒。

本发明的上述目的是通过如下方案予以实现的：

一、本发明的赤点石斑鱼神经坏死病毒检测用引物组，是基于环介导等温扩增技术，根据已公开的赤点石斑鱼神经坏死病毒基因组序列，选取赤点石斑鱼神经坏死病毒基因的特异性序列，然后分析设计出的，能专一性鉴别赤点石斑鱼神经坏死病毒的特异性引物组，通过PCR来鉴定赤点石斑鱼神经坏死病毒基因，该引物组由如下四条引物组成：

内引物FIP，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；

内引物BIP，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；

外引物F3，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；

外引物B3，其核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。

二、采用本发明的赤点石斑鱼神经坏死病毒检测用引物组，按照如下本领域人员进行LAMP反应的常规操作步骤都可对赤点石斑鱼神经坏死病毒进行检测，实现本发明：

(1)提取待测样品核酸后反转录的cDNA；

(2)向反应管中加入上述赤点石斑鱼神经坏死病毒检测用引物组、LAMP反应液和Bst DNA聚合酶，恒温反应；

(3)反应结束后，向反应管中加入显色液，混匀，通过观察颜色判断待测样品中是否含有赤点石斑鱼神经坏死病毒。

上述的LAMP反应体系和反应条件可参考本领域的常规操作或LAMP试剂盒的说明。

为了提高检测的特异性，取得更好的检测效果，本发明人对检测方法进行了优化：

(1)本发明人以0.2uM F3和0.2uM B3为基准，对内外引物的比例进行优化，内引物∶外引物为1∶1～1∶10，最佳比例为1∶4，即0.8uM FIP、0.8uM BIP、0.2uM F3、0.2uM B3、18uL LAMP反应液以及8U BstDNA聚合酶；

(2)LAMP反应时，其LAMP反应液的配方可为：含有1×反应缓冲液、0.2～2.0mM dNTPs、0～1.4M甜菜碱和0～12mM MgSO₄，优选含有1×反应缓冲液、1.2mM dNTPs、0.8M甜菜碱和6mM MgSO₄，所述1×反应缓冲液是本领域技术人员进行Bst DNA聚合酶扩增反应时常用的反应试剂，可采用试剂盒中搭配Bst DNA聚合酶的1×反应缓冲液，其配方通常可包括如下组分：20mM pH 8.8的Tris-HCl、10mM KCl、10mM(NH₄)₂SO₄、2mM MgSO₄和0.1％Triton X-100(0.1％TritonX-100是：Triton X-100占反应液的体积百分比为0.1％)；

(3)LAMP反应时，恒温反应温度可选择58～68℃，最佳为65℃，反应时间可选择40～70min，最佳为60min。

三、根据上述检测方法，本发明人还提供含有赤点石斑鱼神经坏死病毒检测用引物组的试剂盒，该试剂盒包含如下组分：

(1)赤点石斑鱼神经坏死病毒检测用引物组：内引物FIP，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；内引物BIP，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；外引物F3，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；外引物B3，其核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；

(2)阳性对照品：含有赤点石斑鱼神经坏死病毒外壳蛋白基因的质粒；

(3)显色液：可选择任何一种常用的荧光染料，优选SYBR Green I或EvaGreen。

该试剂盒在使用时，先提取待测样品RNA反转录得到cDNA，然后用上述赤点石斑鱼神经坏死病毒检测用引物组进行常规LAMP反应，反应后加入显色液，观察显色结果，并同时对比阳性对照品的显色结果，若显色结果一致，则说明待测样品中含有赤点石斑鱼神经坏死病毒，若不一致，则说明待测样品中不含有赤点石斑鱼神经坏死病毒。

上述试剂盒还可以包含如下组分：

(1)LAMP反应液：含有1×反应缓冲液、0.2～2.0mM dNTPs、0～1.4M甜菜碱和0～12mM MgSO₄，优选含有1×反应缓冲液、1.2mM dNTPs、0.8M甜菜碱和6mM MgSO₄；

(2)Bst DNA聚合酶。

因为本发明的赤点石斑鱼神经坏死病毒为RNA病毒，所以在试剂盒的制备时，配置有RT和核酸提取的试剂，会更加方便试验进展，如Trizol、氯仿(也可自备)、异丙醇(也可自备)、70％乙醇(也可自备)、无RNase水、RT反应液和反转录酶，其中，RT反应液含有1mM dNTPs、10mg/L碱基随即引物和8U反转录酶，反转录酶可选择本领域做RT实验时常用的反转录酶，如反转录酶M-MLV等。

本发明的快速诊断试剂盒里还可以包括一个泡沫板，泡沫板的设计可以为：其大小与本发明试剂盒的底面相同，泡沫板上有不少于试剂盒中所装试剂小管数量的小孔，这样试剂盒中所用试剂分装成的小管可以分别对应放置于这些小孔中，从而使得试剂都能处于小管的下部，方便取用和吸取，也可以使取用时残留在管壁上的液体自动回到管底，节约试剂。

上述快速诊断试剂盒的生产工艺，包括如下步骤：

1、将内引物FIP/BIP和外引物F3/B3合成纯化后，定量配制，浓度检测，分装后抽样质检；

2、将Trizol分装后抽样质检；

3、将氯仿无菌分装，抽样质检；

4、将异丙醇无菌分装，抽样质检；

5、将70％乙醇无菌分装，抽样质检；

6、将无RNase水无菌分装，抽样质检；

7、将RT反应液无菌分装，抽样质检；

8、将LAMP反应液无菌分装，抽样质检；

9、将逆转录酶无菌分装，抽样质检；

10、将Bst DNA聚合酶无菌分装，抽样质检；

11、将显色液无菌分装，抽样质检；

12、将阳性对照标本制备，分装，抽样质检；

13、准备带有小孔的泡沫板；

14、组装试剂盒。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1.引物设计是LAMP技术的关键所在，对于引物设计有许多的要求，如各个引物之间的距离、Tm值以及引物末端稳定性等，因此从200～300个碱基的靶序列中设计四条符合要求的引物存在很大的难度，而本发明根据靶基因序列设计了一种赤点石斑鱼神经坏死病毒检测用引物组，能特异性识别靶序列上的六个独立区域，在Bst DNA聚合酶的作用下启动循环链置换反应，在靶标DNA区启动互补链合成，在同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎-环DNA混合物，由于LAMP技术只有在四条引物完全识别靶序列六个结合区的情况下才能顺利进行，所以本发明的引物组在很大程度上减少了扩增反应的背景影响，大大改善了赤点石斑鱼神经坏死病毒检测的特异性；

2.采用本发明的引物组对赤点石斑鱼神经坏死病毒进行检测，因为高特异性，所以可以根据是否扩增就能判断目标基因的存在与否，从而能够确定样品是否感染RGNNV；

3.本发明的快速诊断试剂盒是利用环介导等温扩增技术快速检测赤点石斑鱼神经坏死病毒，检测灵敏度高，扩增模板仅需10拷贝或更少；

4.本发明的快速诊断试剂盒不但反应条件温和，而且所需仪器简单，也不需要特殊试剂，克服了传统PCR固有的检测时间长、容易污染及检测成本高等缺点；

5.本发明的快速诊断试剂盒扩增快速且高效，在不到1小时即可完成扩增，且产率高；

6.本发明的快速诊断试剂盒鉴定简便，从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg²⁺结合，产生副产物-焦磷酸镁沉淀，可通过肉眼观察鉴定，并且加入显色液后，阴阳性结果显色差异显著，验证率高，更加明显可靠；

7.本发明的快速诊断试剂盒操作简单，对检测人员的技术素质要求较低，可建立成本低廉的快速筛选体系，实现现场高通量快速检测；

8.本发明的快速诊断试剂盒建立了一套经过优化的反转录-环介导等温扩增反应(RT-LAMP)体系，不但使得赤点石斑鱼神经坏死病毒定性检测更加简便快速、特异性高、灵敏度高，而且可用于鱼类养殖过程中各时期的赤点石斑鱼神经坏死病毒跟踪检测，避免病毒传播流行，提高科学管理效率，具有很高的实用价值。

附图说明

图1为实施例1待测样品的RT-PCR检测结果电泳图；

其中，M为Marker DL2000，1为阳性对照，2～9为含有赤点石斑鱼神经坏死病毒的阳性鱼，10～11为不含有赤点石斑鱼神经坏死病毒的健康鱼，12为阴性对照；

图2为实施例4的LAMP反应产物电泳图；

其中，M为Marker，1为阳性对照，2为待测样品的LAMP反应产物，3为阴性对照。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步地阐述，但具体实施例并不对本发明做任何限定。

实施例1赤点石斑鱼神经坏死病毒检测用引物组及有效性检测

本实施例根据已公开的赤点石斑鱼神经坏死病毒基因组序列，选取赤点石斑鱼神经坏死病毒基因的特异性序列，然后分析设计出可用于LAMP检测技术的，能专一性鉴别赤点石斑鱼神经坏死病毒的特异性引物组，该引物组由如下四条引物组成：

内引物FIP，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；

内引物BIP，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；

外引物F3，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；

外引物B3，其核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。

本实施例选择已经由RT-PCR检测的8条阳性鱼和2条健康鱼(如图1所示)，然后分别提取这10条鱼的脑组织的RNA进行上述赤点石斑鱼神经坏死病毒检测用引物组的有效性。

首先将上述引物组中的四条引物送去生物公司合成，然后用反转录试剂盒将10条鱼的RNA反转录为cDNA，接着用赤点石斑鱼神经坏死病毒检测用引物组的四条引物分别对10条鱼的cDNA进行LAMP检测，LAMP反应体系为：0.8uM FIP、0.8uM BIP、0.2uM F3、0.2uM B3、18uL LAMP反应液(含有1×反应缓冲液、1.2mM dNTPs、0.8M甜菜碱和6mM MgSO₄)和8U Bst DNA聚合酶，1uL模板cDNA，65℃恒温反应60min，反应结束后向各反应管中加入SYBR Green I，其中有8个管的颜色变为翠绿色，2个管没有颜色变化依然是橘红色，对比RT-PCR的检测结果，发现颜色变为翠绿色的8个管正是阳性鱼，而没有颜色变化的正好是正常鱼，由此说明本发明的赤点石斑鱼神经坏死病毒检测用引物组可以准确、特异性地检测出赤点石斑鱼神经坏死病毒。

实施例2快速诊断试剂盒的制备

本实施例的快速诊断试剂盒可用于环介导等温扩增技术快速诊断样品中是否含有赤点石斑鱼神经坏死病毒，该试剂盒由赤点石斑鱼神经坏死病毒检测用引物组、LAMP反应液、Bst DNA聚合酶、阳性对照品、显色液和泡沫板组成，其中：

(1)赤点石斑鱼神经坏死病毒检测用引物组：采用DNA合成仪，1管，内装外引物F3、外引物B3、内引物FIP和内引物BIP，内引物FIP，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；内引物BIP，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；外引物F3，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；外引物B3，其核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示，以上4种引物浓度分别为10uM；

(2)配置LAMP反应液：含有1×反应缓冲液、1.2mM dNTPs、0.8MBetaine、6mM MgSO₄，1管；

(3)购置Bst DNA聚合酶，置于容器，1管；

(4)制备阳性对照品：提取含赤点石斑鱼神经坏死病毒基因的质粒DNA，置于容器，1管；

(5)购置显色液：SYBR Green I，置于容器，1管；

(6)一块泡沫板，其大小与长方体盒子的底面相同，高2.4cm，有三排孔，第一排五个孔，孔径1.4cm，第二排六个孔，孔径1.1cm，第三六个孔，孔径0.7cm。

将上述6个小管分别对应放置于泡沫板的孔内，装于盒中即制备得到本实施例的快速诊断试剂盒。

本实施例快速诊断试剂盒的生产工艺，包括如下步骤：

1、将内引物FIP/BIP和外引物F3/B3合成纯化后，定量配制，浓度检测，分装后抽样质检；

2、将LAMP反应液无菌分装，抽样质检；

3、将Bst DNA聚合酶无菌分装，抽样质检；

4、将SYBR Green I无菌分装，抽样质检；

5、将阳性对照标本制备，分装，抽样质检；

5、准备带有小孔的泡沫板；

6、组装试剂盒。

实施例3快速诊断试剂盒的制备

本实施例的快速诊断试剂盒可用于环介导等温扩增技术快速诊断样品中是否含有赤点石斑鱼神经坏死病毒，该试剂盒由赤点石斑鱼神经坏死病毒检测用引物组、LAMP反应液、Bst DNA聚合酶、阳性对照品、显色液、Trizol、氯仿、异丙醇、70％乙醇、无RNase水、RT反应液、反转录酶和泡沫板组成，其中：

(1)赤点石斑鱼神经坏死病毒检测用引物组：采用DNA合成仪，1管，内装外引物F3、外引物B3、内引物FIP和内引物BIP，内引物FIP，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；内引物BIP，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；外引物F3，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；外引物B3，其核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示，以上4种引物浓度分别为10uM；

(2)配置LAMP反应液：含有1×反应缓冲液、1.2mM dNTPs、0.8MBetaine、6mM MgSO₄，1管；

(3)购置Bst DNA聚合酶，置于容器，1管；

(4)制备阳性对照品：提取含神经坏死病毒外壳蛋白基因的质粒DNA，置于容器，1管；

(5)购置显色液：SYBR Green I，置于容器，1管；

(6)购置Trizol，置于容器，5ml/管，2管；

(7)购置氯仿，置于容器，2ml，1管；

(8)购置异丙醇，置于容器，5ml，1管；

(9)制备70％乙醇，置于容器，5ml/管，2管；

(10)制备无RNase水，置于容器，0.5ml/管，1管；

(11)配置RT反应液：含有1×反应缓冲液、1mM dNTPs、10mg/L碱基随即引物、8URNA酶抑制剂，置于容器，0.1ml/管，1管；

(12)购置反转录酶M-MLV，置于容器，1管；

(13)一块泡沫板，其大小与长方体盒子的底面相同，高2.4cm，有三排孔，第一排五个孔，孔径1.4cm，第二排六个孔，孔径1.1cm，第三六个孔，孔径0.7cm。

将上述14个小管分别对应放置于泡沫板的孔内，装于盒中即制备得到本实施例的快速诊断试剂盒。

本实施例快速诊断试剂盒的生产工艺，包括如下步骤：

1、将内引物FIP/BIP和外引物F3/B3合成纯化后，定量配制，浓度检测，分装后抽样质检；

2、将Trizol分装后抽样质检；

3、将氯仿无菌分装，抽样质检；

4、将异丙醇无菌分装，抽样质检；

5、将70％乙醇无菌分装，抽样质检；

6、将无RNase水无菌分装，抽样质检；

7、将RT反应液无菌分装，抽样质检；

8、将LAMP反应液无菌分装，抽样质检；

9、将反转录酶M-MLV无菌分装，抽样质检；

10、将Bst DNA聚合酶无菌分装，抽样质检；

11、将SYBR Green I无菌分装，抽样质检；

12、将阳性对照标本制备，分装，抽样质检；

13、准备带有小孔的泡沫板；

14、组装试剂盒。

实施例4赤点石斑鱼神经坏死病毒快速诊断试剂盒的应用

本实施例采用实施例2制备所得试剂盒，采用LAMP技术对待测样品是否含有赤点石斑鱼神经坏死病毒进行快速检测，其具体步骤如下：

(1)向匀浆器中加入赤点石斑鱼脑组织，并加入约待测样品10倍体积的Trizol液稀释，冰浴匀浆，室温静置3min；

(2)向上述匀浆液中加入200μl氯仿，上下颠倒混匀，室温静置5min；

(3)4℃，12000r/min离心10min；

(4)取300μl上清，加入等体积异丙醇，轻轻晃动后，室温静置10min；

(5)4℃，12000r/min离心10min；

(6)弃上清，用1ml预冷的70％乙醇洗涤2次，4℃，10000r/min离心5min；

(7)空气干燥，加20-50μl无RNase水溶解，得到RNA提取液；

(8)将上述RNA提取液在65℃温育5min，立即置于冰上冷却；

(9)取2μl冷却后的RNA提取液，0.5μl反转录酶M-MLV，一起加入到7.5μl RT反应液中，37℃孵育1h；然后95℃处理5min，得到LAMP反应模板；

(10)按照LAMP反应体系为0.8uM FIP、0.8uM BIP、0.2uM F3、0.2uMB3、18uL LAMP反应液、8U Bst DNA聚合酶、1uL模板cDNA，将模板cDNA、引物、Bst DNA聚合酶和LAMP反应液等混合到反应管中，混匀后离心数秒，置于PCR仪中，65℃反应1小时，然后80℃，10min，4℃保存；

(11)反应结束后在反应管和阳性对照管中分别加入1μl SYBR Green I，混匀后，阳性对照管中颜色为翠绿色，而反应管中的颜色也为翠绿色，说明本实施例的待测样品含有赤点石斑鱼神经坏死病毒；

(12)LAMP反应结束后，将反应产物和阳性对照一起进行琼脂糖凝胶电泳，20分钟后于紫外仪上观察，同时也做一个阴性对照(不含有赤点石斑鱼神经坏死病毒)，电泳结果如图2所示，可以看出阳性对照出现阶梯状反应条带，LAMP反应产物的电泳带和阳性对照一样，阴性对照无条带出现，说明待测样品中含有赤点石斑鱼神经坏死病毒。

上述电泳结果和显色反应结果是一致的，说明本发明的快速诊断试剂盒可准确、特异性地检测赤点石斑鱼神经坏死病毒。

一种赤点石斑鱼神经坏死病毒检测用引物组、检测方法和快速诊断试剂盒 序列表SEQUENCE LISTING

<110>中国水产科学研究院南海水产研究所

<120>一种赤点石斑鱼神经坏死病毒检测用引物组、检测方法和快速诊断试剂盒

<130>

<160>4

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

acgagttgct tgaagcgcgt cctggcttcc tgcctgatc                      39

<210>2

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

ggtgggaaag cagaacagtc cgctcctttc ccgacgaggt                     40

<210>3

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

aatgtgcccc gcaaacac                                             18

<210>4

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

cgaccaggtg acgtgaga                                             18