水稻多效基因CCT35和HAP家族基因功能鉴定

摘要

我们前期在对水稻产量的研究中发现多效性基因Ghd7，长日条件下能够增加水稻的每穗粒数和株高，延迟抽穗，从而显著提高单株谷物产量。Ghd7编码一个含有CCT结构域的转录蛋白。在水稻中CCT是一个大家族，该家族含有包括Hd1和Ghd7等重要开花调控基因在内的41个成员，其中CCT35与Ghd7同源性最高。CCT结构域与酵母HAP2/3/5复合体中HAP2亚基的DNA结合区域同源。在拟南芥中CCT类蛋白CO能够与HAP3/HAP5形成三聚体，调控下游基因的表达，从而调控植株的开花。在水稻中已经有部分HAP家族基因被证明参与水稻开花期的调控。
　　本研究对CCT35的功能进行鉴定，筛选了与它互作的HAP蛋白，同时还利用基因编辑分析了HAP家族基因功能。珍汕97背景的CCT35超表达转基因材料存在两个不同程度的表型变异，分别记作M型和L型。在长日照条件下，M型抽穗延迟18d，株高增加20cm，一次枝梗数增加54％，二次枝梗数增加102%，单株产量提高55%；L型抽穗延迟26d，株高增加18cm，一次枝梗数增加50%，二次枝梗数增加73%，单株产量提高55%。通过酵母双杂交实验，在中花11的30天苗期叶片cDNA文库中筛选到10个候选的互作基因。其中一个基因与调控水稻穗发育的基因LAX1同样属于bHLH家族。LAX1对侧生分生组织的发生与维持至关重要，正调控水稻一次枝梗及二次枝梗数目。CCT35可能能够与该蛋白互作参与水稻穗发育的调控。同时我们发现CCT35能够在酵母中与2个HAP2家族成员，5个HAP3家族成员以及9个HAP5家族成员互作。CCT35与可能与OsHAP5/OsHAP3形成复合体参与开花期的调控。为了探究在HAP家族中哪些基因能够参与水稻开花期的调控，我们利用CRISPR技术对35个HAP家族基因进行敲除，最终获得23个基因的阳性家系。仅在LH3-2转基因植株的T1代个体中发现2个家系表现出开花期延迟、株高增加的表型。这说明HAP家族基因存在功能冗余。对LH3-2两个家系进行鉴定，发现一组同源性较高的基因OsHAP3B/OsHAP3C的碱基缺失是造成这一改变的主要原因。

目录

声明

缩略词表

1 前言

1.1 水稻产量相关基因的研究

1.2 开花期相关研究

1.3 CCT家族相关研究

1.4 HAP家族相关研究

1.5 基因编辑相关研究

1.6 研究意义

2 材料与方法

2.1 CCT35超表达材料及转化材料

2.2 田间种植和性状考察

2.3 实验所用菌株和载体

2.4 酵母双杂交筛库（Invitrogen）

2.5 酵母双杂交载体（clontech）的构建

2.6 酵母双杂实验验证蛋白互作

2.7 DNA抽提

2.8 RNA的提取，RT-PCR和Real time PCR

2.9 HAP家族CRISPR材料构建

2.10 PAGE胶检测CRISPR单株

3 结果与分析

3.1 CCT35转基因植株性状及产量

3.2 CCT35转基因植株拷贝数检测

3.3 CCT35转基因植株中CCT35表达量检测

3.4 珍汕97及日本晴中CCT35序列比较

3.5 CCT35酵母筛库

3.6 CCT35与HAP家族的基因在酵母中互作

3.7 HAP家族基因CRISPR敲除的转基因植株鉴定

3.8 HAP家族基因敲除突变体的表型鉴定

4 讨论

4.1 CCT35参与水稻穗型及开花期的调控

4.2 HAP家族CRISPR有待继续发掘信息

参考文献

附录A

附录B Southern Blotting

致谢