Amelogenin C-末端短肽调控磷酸钙晶体表面生长的动力学及机制研究

摘要

矿物-水界面反应是生物地球化学过程中最基础的关键研究内容。其中，在微观矿物界面上发生的溶解和沉淀（表面生长）反应最能直接影响土壤地球化学过程中的矿物元素循环、养分有效性、重金属的去向以及生物矿化过程（无机元素吸收进入生物体后形成矿物的过程）等。在每一个特定过程中，反应速率及动力学(Kinetics)最终由矿物界面以及界面液体中所包含的各种有机、无机添加（杂质）分子和离子组分所控制。所以，研究反应过程中有机大分子-矿物界面的相互作用对晶面生长动力学过程及晶体形貌的调控作用尤为重要。目前，借助最新发展的原位观测手段和单分子力谱，可以直接实时观测纳米级矿物表面反应和无机矿物与有机分子之间的相互作用，这有助于揭示发生在矿物-水界面上的反应机制。本研究以普遍存在于土壤和生物体内的磷酸钙矿物以及一种在生物矿化过程中被广泛研究的模式蛋白Amelogenin的C-末端短肽为实验材料，使用原子力显微镜(AFM)原位观测矿物-水界面反应的动力学过程。并在AFM针尖表面化学修饰上单个短肽分子，利用AFM单分子力谱在单分子水平上测定了短肽和磷酸钙矿物表面的结合能。此外，结合短肽的生物化学荧光标记和修饰等研究最终探明AmelogeninC-末端短肽自组装体和分子单体在调控磷酸钙矿物界面生长具有不同的动力学和热力学（Thermodynamics）（统称Dynamics）机制。此微观机制的研究为研究其它复杂土壤矿物和生物矿物的界面反应提供了线索和方法上的探索。此研究得出的主要结论如下:
　　1、单体Amelogenin C-末端短肽通过修饰二水磷酸氢钙(DCPD)-水界面的界面能来修饰DCPD(010)面上生长螺旋的临界长度以及台阶宽度，从而抑制DCPD晶体表面的螺旋生长。
　　在过饱和度(相对于DCPD的σ=0.344-0.659)范围确定的系列溶液中，首先利用原位AFM实时测量了DCPD(010)面上三角形螺旋生长的速度（即三个台阶移动的速度），发现1-200 nM Amelogenin C-末端短肽并不影响三个台阶移动的速度，但低浓度(1-10 nM) Amelogenin C-末端短肽显著减小了两个生长相对较快的台阶（[10(1)]Cc和[101]Cc）的密度（即增加了台阶宽度），同时，当浓度超过50 nM后此效应逐渐减小，增加溶液过饱和度加速了此效应的消失。随后，我们测量了台阶临界长度（Lc），发现在不添加短肽的过饱和溶液中，Lc随着溶液过饱和度σ的降低而增加。同时，在同一固定饱和度σ下，Lc随着短肽浓度（10nM到1nM）减小而快速增加;但是，当短肽浓度超过50nM后，Lc反而不发生改变。最后我们通过其它手段表征不同浓度的短肽颗粒粒径，发现低浓度的短肽以单体形式存在，它通过吸附在DCPD(010)面上并与矿物表面有着较强的相互作用，从而通过改变DCPD-水界面的界面能来影响晶体移动的台阶临界长度以及台阶宽度，进而在生长的晶面上延缓了可移动台阶的形成，起到抑制DCPD生长的作用。而当浓度过高时，短肽则因自组装形成团聚体，导致其与矿物表面的相互作用降低，从而减弱了对DCPD生长的抑制作用。本研究为理解生物矿物及土壤矿物的形成和生长提供了界面能控制方面的微观机制。
　　2、原位观察到磷酸八钙(OCP)晶体(100)面通过非经典的粒子粘附方式生长;在生长过程中，自组装伸长的Amelogenin C-末端短肽控制了OCP纳米颗粒的形貌，使球形粒子也按同等比例伸长，揭示了Amelogenin C-末端短肽的自组装体对OCP晶面生长形貌的调控机制。
　　在精确定义的热力学驱动力（过饱和度）、pH和离子强度的条件下，借助原位AFM实时观测OCP晶体(100)面生长的过程中，发现与DCPD表面生长不同，OCP的生长并不是以经典的螺旋或岛状的方式生长，而是以非经典粒子粘附的方式进行。同时，在生长过程中加入特定浓度(50 nM) Amelogenin C-末端短肽，其自组装后可以明显诱导OCP纳米粒子的伸长，其长宽比从1∶1增加到2∶1，而当浓度增加到100 nM后此效应消失。最后，通过原位AFM观察发现100 nM短肽在OCP晶面上出现了去组装现象。通过观察经生物标记荧光修饰的短肽在OCP晶体表面的沉积，说明特定浓度的短肽在OCP晶面上可以进行自组装和去组装。此结果有利于理解有机分子如何控制晶体通过颗粒粘附方式生长时的形貌修饰作用的机制。
　　3、通过AFM单分子力测定，探明Amelogenin C-末端短肽在OCP晶体(100)面上可形成伸长的自组装体，再吸附和结合OCP溶液中的纳米粒子在其表面生长。
　　在AFM针尖修饰上Amelogenin C-末端短肽，直接测量单个短肽分子和OCP晶体(100)面的结合强度。在磷酸缓冲液中，通过直接测量修饰了短肽的针尖和OCP(100)面接触的力-距离曲线，并将其转化为分离短肽-OCP键合所做的功（W），最后得到短肽和OCP晶面的结合自由能为△GB=-26.0 kcal/mol。作为对照，短肽和云母表面结合能仅为-10.3 kcal/mol。结合原位OCP生长动力学和AFM单分子力谱的研究，进一步表明Amelogenin C-末端氨基酸序列中最末位的酸性氨基酸（天冬氨酸以及谷氨酸）暴露在短肽组装体表面并具有结合Ca-P纳米颗粒的能力。并且，这些短肽可以通过自组装形成组装体，进而诱导形成伸长的磷酸钙纳米颗粒。此结果加深了在单分子水平上理解有机分子和矿物界面相互作用以及晶体生长过程中出现的形貌修饰作用的机制，这也将为揭示发生在复杂土壤地球化学和其他生物矿化体系中矿物-水界面上的沉淀（生长）反应提供微观动力学和热力学的研究线索。

目录

声明

摘要

缩略语表

1．文献综述

1．1．1 土壤环境中矿物—水界面反应

1．1．2 生物环境中矿物—水界面反应

1．2．1 概述

1．2．2 无定形磷酸钙(ACP)

1．2．3 二水磷酸氢钙(DCPD)

1．2．4 磷酸三钙(TCP)

1．2．5 磷酸八钙(OCP)

1．2．6 羟基磷灰石(HAP)

1．3．1 溶液中晶体的成核

1．3．2 经典的晶体生长方式：螺旋生长

1．3．3 非经典的晶体生长方式：颗粒粘附(CPA)

1．4 有机分子调控磷酸钙晶体生长的机制

1．4．1 概述

1．4．2 台阶阻滞

1．4．3 对台阶动力学的影响

1．4．4 添加分子影响台阶密度以及晶体界面能

1．5 AFM针尖功能化的单分子力谱测定晶体与短肽之间的相互作用

1．6 需要解决的问题

2．课题研究背景、内容和技术路线

2．1 研究背景和意义

2．2 研究内容

2．3 技术路线

3．Amelogenin C-末端短肽单体修饰二水磷酸氢钙表面生长的动力学机制

3．1 前言

3．2 材料与方法

3．2．1 含13个氨基酸残基的Amel短肽合成

3．2．2 用于AFM下使用的DCPD晶体的合成

3．2．3 原位AFM下DCPD晶体的表面生长

3．2．4 DCPD体相成核实验

3．2．5 通过AFM和DLS测量短肽颗粒的大小

3．2．6 静态接触角测量以及DCPD的表面自由能

3．3 结果与讨论

3．4 小结

4．Amelogenin C-末端短肽对磷酸八钙表面粒子粘附生长的调控机制

4．1 前言

4．2 材料与方法

4．2．1 含13个氨基酸残基的Amelogenin C-末端短肽(13-mer Amel)的合成以及短肽的FITC荧光标记

4．2．2 OCP晶体的合成

4．2．3 过饱和溶液的制备

4．2．4 OCP晶体表面生长

4．2．7 动态光散射(DLS)

4．3 结果与讨论

4．3．1 纯的过饱和溶液条件下OCP晶体的表面生长

4．3．2 Amelogenin C-末端短肽调控OCP晶体的表面生长

4．3．3 在颗粒粘附生长过程中Amelogenin C-末端短肽所起的作用

4．4 小结

5．单分子尺度上的Amelogenin C-末端短肽-磷酸八钙(100)面的相互作用

5．1 前言

5．2 材料与方法

5．3 结果与讨论

5．3．1 单分子力的测定及拟合相关理论

5．3．2 Amelogenin C-末端短肽在OCP(100)面上的结合自由能

5．4 小结

6 全文总结与展望

6．1 主要结论

6．2 创新点

6．3 展望

参考文献

常用仪器型号及品牌

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