大豆鞘脂羟化酶、磷脂磷酸水解酶基因克隆及其功能研究

摘要

大豆起源于中国，是我国乃至世界上重要的粮食作物和油料作物。大豆作为丰富、廉价的鞘脂和磷脂的来源，多用于食物及药物中。目前国内外关于脂类的研究多见于模式植物中，其代谢过程中信号转导的各类关键酶基因在大豆中的功能研究则比较少。为了分析大豆中GmSBH、GmPAH基因对脂类的影响，本研究通过构建CRISPR载体、RNAI载体、过表达载体、互补型载体等进行相关基因的克隆并分别对其功能进行研究，以此检测在大豆转基因发根中鞘脂的含量变化、发根结瘤表型情况及其三酰甘油的含量变化。
　　本研究通过对GmSBH基因对其进行大豆的下胚轴侵染检测其过量表达及CRISPR基因敲除后发现在大豆植株中发根中结瘤数目的不同变化：过量表达GmSBH01G与GmSBH02G根瘤数目明显高于GFP对照，GmSBHU6(CRISPR基因敲除)的根瘤数目则是显著低于对照GFP；而对于通过组织培养筛选到的转基因发根中鞘氨醇含量的变化则分别是过量表达中GmSBH01G与GmSBH02G的显著低于GFP对照，尤其是GmSBH02G最为明显，GmSBHU6则明显高于对照GFP，而植物鞘氨醇的含量变化结果与鞘氨醇正好相反。鉴于目前本实验受大豆转基因技术限制暂时无法得到大豆的转基因植株，而用于三酰甘油检测的材料是大豆转基因发根和模式植物的种子。结果表明：在大豆转基因发根中GmPAH13G的TAG含量显著高于对照GFP，且 GFP明显高于GmPAH13GRi和GmPAHU6；拟南芥纯合种子中过量表达的TAG含量明显高于互补型，而互补型则稍高于野生型、野生型则明显高于突变体种子。

目录

声明

缩略语表

1.文献综述

1.1研究问题的由来

1.2鞘脂类的研究现状

1.2.1 鞘脂的结构

1.2.2鞘脂的代谢途径

1.2.3植物中鞘脂的作用及其研究现状

1.3磷脂类的研究现状

1.3.1磷脂酶的结构

1.3.2磷脂水解酶的作用

1.3.3磷脂水解酶的研究现状

1.4研究目的及其意义

2 实验材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1植物材料

2.1.2菌株及载体

2.1.3 主要分子生物学试剂

2.1.4 培养基

2.1.5 实验常用仪器

2.2实验方法

2.2.1植物材料总RNA的提取

2.2.2 cDNA 第一链的合成

2.2.3基因组 DNA抽提

2.2.4 目的基因序列查找选择及引物设计

2.2.5 目的基因的克隆

2.2.6 载体的构建

2.2.7 大豆发根的转化

2.2.8 农杆菌介导的拟南芥遗传转化

2.2.9 脂类的提取

3. 结果与分析

3.1 GmSBH的基因功能验证

3.1.1 GmSBH的生物信息学分析

3.1.2 GmSBH大豆转基因发根鉴定

3.1.3转基因发根鞘脂分析

3.1.4 GmSBH基因结瘤统计与分析

3.2 GmPAH的基因功能验证

3.2.1 GmPAH的生物信息学分析

3.2.2 GmPAH大豆转基因发根鉴定

3.2.3 GmPAH大豆转基因发根TAG检测

3.2.4 GmPAH基因在拟南芥种子中TAG表达量

4 结论与讨论

4.1结论

4.2讨论

参考文献

附录：本实验所用引物

致谢