绿色荧光蛋白基因转化早花柠檬创制新种质

摘要

柑橘是世界上重要的水果之一。但柑橘存在童期长的问题，严重影响了传统育种方法的效率。近年来不断发展的转基因技术为柑橘研究提供了更快速的方法，而采用短童期材料可加速研究进程。
　　本实验以短童期材料-早花柠檬的试管实生苗上胚轴为外植体，采用根癌农杆菌介导法进行绿色荧光蛋白基因转化，最终得到了8株转基因再生植株。同时对影响早花柠檬转化效率的因素进行了探讨。主要结果如下:
　　1.转绿色荧光蛋白基因早花柠檬植株再生。共进行了7批材料的转化，总计2215个茎段，平均再生芽率60.6％，最高达75％。经体式荧光显微镜检测，表明再生芽平均阳性率1.8％，最高达2.8％。最终8个阳性芽生根并移栽至温室;再生植株茎段和叶片荧光明显，经PCR检测为阳性，表明再生植株均为阳性植株。
　　2.影响转化效率的因素研究。分别设置3个乙酰丁香酮和农杆菌浓度，发现乙酰丁香酮浓度变化对转化率影响不大;转化率随着农杆菌浓度增加而降低，农杆菌浓度OD600在0.6最适宜。转化过程中发现，该基因型暗培一周的上胚轴切口可形成愈伤组织;一般一个切口再生一个不定芽，极少再生多个不定芽，只有极少的两端均再生不定芽;该上胚轴共培后易黄化，切口处再生愈伤能力较弱，部分上胚轴易褐化、不易再生不定芽，即使使用生长状态良好的实生苗依然出现上述情况。

目录

声明

摘要

缩略词表

1．前言

1．1 课题的提出

1．2．1 果树童期概述

1．2．2 果树童期特征

1．3 柑橘遗传转化研究进展

1．3．1 遗传转化方法

1．3．2 外植体

1．3．3 导入的外源基因

1．3．4 影响遗传转化效率的因素

1．3．5 柠檬遗传转化研究进展

1．4．1 GFP简介

1．4．2 GFP应用特点

1．4．3 GFP应用现状

1．5 本研究目的意义及内容

2．材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 遗传转化外檀体材料

2．1．2 农杆菌菌株和质粒

2．1．3 转化中所用培养基配方

2．1．4 实验主要用到试剂

2．2 试验方法

2．2．1 早花柠檬实生苗的准备

2．2．2 根癌农杆菌侵染液的制备

2．2．3 外植体的准备与侵染

2．2．4 筛选与继代

2．2．5 再生芽荧光检测

2．2．6 阳性芽的生根与移栽

2．2．7 再生苗荧光及PCR检测

3．结果与分析

3．1 早花柠檬种子数

3．2 早花柠檬茎段转化植株的再生

3．3 再生率与转化率

3．4 转化后的荧光检测

3．6 再生植株的PCR鉴定

3．7 影响转化效率的因素

4．讨论

4．1 基因型对转化的影响

4．2 遗传转化过程中外植体的选择

4．3 外植体状态

4．4 共培养时间及温度

4．5 小结与展望

参考文献

致谢