多粘类芽胞杆菌KN-03抗青枯病活性物质发酵优化及分离纯化

摘要

由青枯劳尔氏菌(Ralstonia solanacearum)引起的植物青枯病是一类世界性的土传植物病害,其危害重、损失大、分布广，但目前并没有有效的控制方法。本研究以一株对青枯病原菌有拮抗作用的多粘类芽胞杆菌KN-03为研究对象，通过优化KN-03胞外抗菌活性物质的发酵培养基和培养条件，初步探讨KN-03抑菌物质的理化性质，对其抗菌物质进行分离纯化，为利用KN-03抗菌活性物质防治青枯病建立基础，并为新型生物农药研究和生物防治提供参考。主要研究结果如下。
　　对菌株Paenibacillus polymyxa KN-03所产抗青枯病原菌活性物质进行了发酵工艺优化。培养基优化结果为（g/L）：豆粕80，玉米淀粉35，K2HPO3·3H2O0.75，MgSO4·7H2O0.40，CaCl20.50，FeSO4·7H2O0.025，MnSO4·H2O0.05，优化的发酵培养条件为：种子液时间为14h，接种量为2％（v/v），250mL三角瓶装液30mL，初始pH中性，培养周期为48h。在优化的发酵培养基和培养条件下，KN-03抗菌活性物质产生的抑菌圈直径从20.10mm增加到了28.30mm。
　　对P.polymyxa KN-03抗青枯病原菌活性物质稳定性及耐受性进行了初步探究，结果表明该抑菌物质具有一定耐热性，能够在温度100℃以下保持80%以上的抑菌活性。该抑菌活性组分具有一定的酸碱耐受性，中性范围内，抑菌活性没有损失，而在pH2-pH4活性有略微的减弱，在pH10-pH12活性有一定的降低，但活性仍然保持在70%以上。该抑菌活性成分对胰蛋白酶、胃蛋白酶和蛋白酶K具有耐受性，紫外条件处理下，抑菌活性能保持稳定。
　　以抗青枯病原菌活性物质为研究对象，用酸沉淀、饱和硫酸铵沉淀、有机溶剂提取，高效液相色谱法对P.polymyxa KN-03发酵液抗菌物质进行分离纯化。发酵上清液分别与甲醇、乙醇或丙酮混合，沉淀无抑菌活性；分别用乙酸乙酯、正丁醇、正己烷或氯仿这四种有机溶剂进行萃取，乙酸乙酯、正丁醇能萃取部分抑菌物质，但萃取率很低；上述结果表明和报道的多粘类芽胞杆菌产生的肽类物质性质类似，P.polymyxa KN-03发酵液抗青枯病原菌活性物质是一类极性较大的物质。通过HPLC反相色谱对粗提物进行洗脱分离纯化，能分离纯化出抑菌活性物质，再与多粘菌素B标准品HPLC检测结果进行对比，判断发酵产物里面主要的抑菌活性物质有多粘菌素B1。

目录

声明

1 前言

1.1 引言

1.2 多粘类芽胞杆菌的研究现状

1.2.1 多粘类芽胞杆菌的分类地位

1.2.2 多粘类芽胞杆菌产生的抗菌物质及抑菌作用机制

1.3 微生物产抗菌物质的发酵工艺优化

1.3.1 发酵培养基优化

1.3.2 发酵条件优化

1.4 抗菌活性物质的分离纯化技术研究进展

1.4.1 发酵液的预处理

1.4.2 抗菌物质的分离纯化

1.5 研究的目的及意义

2 材料和方法

2.1 实验材料

2.1.1 菌株

2.1.2 培养基

2.1.3 试剂

2.1.4 主要仪器

2.2 实验方法

2.2.1 抑菌活性的检测

2.2.2 抗菌物质发酵工艺优化

2.2.3 抗菌物质理化性质检测

2.2.4 抗菌物质分离纯化

2.2.5 数据处理

3 结果与分析

3.1 抗菌活性物质发酵工艺优化

3.1.1 抗菌活性物质发酵培养基优化

3.1.2 抗菌活性物质发酵条件优化

3.2 发酵上清液抗菌活性物质的理化性质

3.2.1 活性物质热处理稳定性

3.2.2 活性物质对酸碱的稳定性

3.2.3 活性物质对蛋白酶的耐受性

3.2.4 活性物质对紫外的耐受性

3.3 发酵上清液抗菌活性物质的分离纯化

3.3.1 发酵上清液酸沉淀

3.3.2 发酵上清液硫酸铵沉淀

3.3.3 有机溶剂提取

3.3.4 高效液相色谱分离纯化

4 结论与讨论

4.1 主要结论

4.2 讨论与展望

参考文献

附录

致谢