解淀粉芽胞杆菌JK3发酵优化及抗青枯活性物质鉴定

摘要

解淀粉芽胞杆菌JK3（Bacillus amyloliquefaciens JK3）是从烟草根际土壤中分离出来的有益菌株，它对引起茄科植物产生青枯病的青枯雷尔氏菌有明显的抑制效果。目前，我们已经将其制成制剂，应用于烟草青枯病的防治。制剂中起主要作用的是芽胞，其次是该芽胞杆菌产生的活性物质。本研究中，对该芽胞杆菌的发酵进行了优化，以增加活菌数及活性物质的产量，并对其抗青枯菌活性物质进行了分离鉴定。
　　本研究通过单因素实验、Plackett-Burman实验设计、爬坡实验及中心组合实验（Central Composite Design，CCD），对该株解淀粉芽胞杆菌JK3进行发酵条件优化。最终确定小麦粉、豆粕粉、K2HPO4的浓度分别为14.57 g/L、9.75g/L、5.46g/L时，活菌数和抑菌圈直径均能取到较大值，预测值分别为28.63×108、1.95cm。按此配方进行验证，每组重复3次，得到实际值为（26.53±3.87）×108、1.82±0.03cm，预测精度为92.7％和93.3%，优化后的培养基较LB分别提高了122.38%、30%。本文对温度、初始 pH、接种量等条件进行了优化，得到在温度、初始 pH、接种量分别为34℃、5、2%时活菌数达到最大；温度、初始pH分别为31℃、8时抗青枯活性最大，接种量对抗青枯活性的影响不大。在进行发酵条件优化时，我们发现，活菌数与抗青枯菌活性之间存在一定的负效应。考虑到发酵主要目的为提高活菌数，故此以活菌数最大的条件为发酵条件。按优化好的发酵培养基及培养条件进行3.5 L小型发酵罐发酵，活菌数及抑菌圈直径分别为（41±7）×108、1.38±0.02 cm。
　　对抗青枯菌活性物质的鉴定中，通过HPLC和MALDI-TOF-MS检测以及脂肽类抗生素Surfactin与纯化得到Iturin和Fengycin混合物进行抗青枯菌活性检测，我们初步判定活性物质为脂肽类抗生素 Surfactin。但在进一步确定活性物质是否为Surfactin时，我们发现 Surfactin基因敲除菌发酵液中依然存在质荷比1044、1058的物质，因此，难以直接确定抗青枯菌活性物质是否为Surfactin，有待进一步鉴定。

目录

声明

1 前言

1.1 青枯病致病菌

1.1.1 青枯菌的表型特征

1.1.2 青枯菌分类

1.1.3 青枯菌侵染过程

1.1.4 青枯菌致病机理

1.1.5 青枯病的防治

1.2 芽胞杆菌的生防机制

1.2.1 竞争作用

1.2.2 拮抗作用

1.2.3 溶菌作用

1.2.4 诱导植物抗性

1.2.5 促进植物生长

1.3 发酵优化

1.3.1 Plackett-Burman 设计

1.3.2 响应面分析（Response Surface Methodology，简称 RSM）

1.4 研究目的和意义

2 材料和方法

2.1 实验材料

2.1.1 供试菌株

2.1.2 培养基

2.1.3 主要试剂与仪器设备

2.2 实验方法

2.2.1 发酵优化

2.2.2 抗青枯活性物质鉴定

2.2.3 Surfactin基因敲除

3 结果

3.1 发酵条件优化

3.1.1 单因素实验

3.1.2 Plackett-Burman 设计实验结果

3.1.3 最陡爬坡实验结果

3.1.4 响应面实验结果分析及验证

3.1.5 培养温度的优化

3.1.6 初始pH的优化

3.1.7 接种量的优化

3.1.8小型发酵罐扩大发酵

3.2 抗青枯活性物质鉴定

3.2.1 活性物质热稳定性

3.2.2 抗青枯活性物质初步纯化

3.2.3 活性物质全波长扫描

3.2.4 HPLC检测

3.2.5 MALDI-TOF-MS检测

3.3 Surfactin基因敲除

3.3.3 基因敲除菌菌落形态

3.3.4 基因敲除菌抗青枯活性检测

3.3.5生长曲线

3.3.6 敲除菌MALDI-TOF-MS检测

4 讨论与小结

4.1 讨论

4.2 小结

参考文献

致谢