P.multocida致雏鸭肝损伤中坏死性凋亡的存在及机制研究

摘要

细菌性肝病一直是我国肝病研究的重点方向。多杀性巴氏杆菌（Pasteurellamultocida，P.multocida）感染人会引起肝硬化、慢性肝炎等，感染鸭会致使肝出现弥漫性的针尖状坏死灶。目前，有关鸭肝损伤的机制还不清楚。细菌感染致机体器官出现坏死灶后，机体细胞会出现多种死亡方式，如沙门氏菌、布鲁氏菌感染后机体细胞会出现坏死、细胞凋亡、坏死性凋亡、自噬等。坏死性凋亡是基因调控的细胞坏死，参与多种疾病的发生、发展，例如缺血再灌注损伤、酒精性肝病、禽伤寒等。当坏死性凋亡信号通路受到抑制后，上述疾病对组织的损伤会相应的减轻，坏死性凋亡依此成为治疗疾病新的潜在靶点而备受关注。RIPK3、MLKL是坏死性凋亡的关键分子，MLKL的高表达会引起细胞坏死性凋亡的发生，随后释放MMP9、HMGB1等坏死相关分子和TNF-α、IL-6等炎症因子。本研究拟探讨雏鸭在感染P.multocida后，肝损伤中细胞死亡方式，及坏死性凋亡信号通路在禽霍乱致肝损伤中的作用。
　　3周龄雏鸭感染P.multocida后，剖检可见肝表面和切面弥漫着针尖大小的白色坏死点。镜下观察可见肝组织内有大量异嗜性粒细胞和淋巴样细胞团的浸润，有大量的死亡细胞形成的坏死灶，并可见细菌团块。IHC检测可见在肝窦、坏死区域以及肝细胞、异嗜性粒细胞、肝窦内皮细胞等中有细菌。细菌在肝组织中的分布情况与病理变化程度相关。感染后，雏鸭血清中T-pro、Glob和Alb的含量明显上升。机体正在积极的产生抗体对抗感染。
　　雏鸭感染P.multocida24h后，HE染色可见肝组织中出现大量坏死灶，IHC检测在肝组织中可见Caspase3、Cleaved Caspase3、MLKL强阳性信号。Caspase3作为细胞凋亡的关键分子，其高表达说明了细胞凋亡的发生。MLKL的高表达说明了坏死性凋亡的发生。在P.multocida感染的肝组织中同时存在凋亡和坏死性凋亡的发生。P.multocida感染腹腔巨噬细胞后，细胞出现明显的空泡化、肿胀、膜破裂，细胞出现死亡。
　　RIPK3、MLKL在P.multocida感染的巨噬细胞和鸭肝组织中，基因转录水平均升高。在感染后24h、48h，MLKL蛋白在肝组织中有明显表达，与对照组相比阳性信号明显增多。P.multocida感染鸭致肝坏死激活了RIPK3/MLKL信号通路。
　　TLR4、TRIF、RIPK1、TNF-α和IFN-β是坏死性凋亡信号通路的上游分子。感染后TLR4基因转录水平的表达量升高，但各时间点间差异不显著。TRIF的基因转录水平的表达量在12h时下调，48h明显上调。RIPK1基因转录水平的表达量在感染后6h时显著上调，其他时间点未明显上调。在P.multocida感染巨噬细胞后RIPK1的基因转录水平也为明显上调。感染24h后，RIPK1在肝组织中的阳性信号明显增多，表达明显增多。
　　肝损伤发生后，肝组织产生并释放多种炎症因子。雏鸭感染P.multocida后，TNF-α和IFN-β基因转录水平均在48h明显升高。IFN-β基因转录水平在12h时下调。感染后IL-6、HMGB1、MMP9和TIMP1在肝组织中的表达量随肝病变程度而变化，24h、48h阳性信号明显增多，表达明显增多。
　　结论:P.multocida感染雏鸭致肝损伤中有坏死、细胞凋亡和坏死性凋亡参与。在此过程中，坏死性凋亡信号通路RIPK3/MLKL通路被激活了，释放的TNF-α、IL-6、HMGB1、MMP9参与肝损伤的过程。

目录

声明

摘要

缩略词表

前言

1．1 非感染性肝病

1．2 感染性肝病

2 多杀性巴氏杆菌病概述

2．1 P．multocida病原学特性

2．2 流行性学

2．3 临床特征及病理变化

2．4 多杀性巴氏杆菌发病机制

3 坏死性凋亡研究进展

3．1 坏死性凋亡的信号通路

3．2 坏死性凋亡与肝损伤

3．3 坏死性凋亡与细菌性疾病

4 研究目的与意义

材料与方法

1．1 主要仪器设备

1．2 主要试剂

1．3 供试菌株

1．4 试验动物

2 试验方法

2．1 细菌的复苏和培养

2．2 主要试剂的配制

2．3 试验动物的饲养与处理

2．4 P．multocida感染动物模型的复制

2．5 血清肝损伤相关生化指标的测定

2．6 组织总I讯A的提取

2．7 RT-PCR、实时荧光定量PCR扩增目的基因

2．8 HE染色

2．9 免疫组织化学染色

2．10 鸭腹腔巨噬细胞的分离、培养

2．11 P．multocida感染腹腔巨噬细胞

3 数据统计与处理

结果与分析

1．1 雏鸭腹腔巨噬细胞的分离与培养

1．2 腹腔巨噬细胞感染P．multocida后细胞病理变化

1．3 P．multocida感染诱导巨噬细胞激活RIPK3／MLKL信号通路

2 动物实验结果

2．1 感染P．multocida后雏鸭的临床症状

2．2 感染P．multocida后雏鸭的大体解剖病变

2．3 感染P．multocida后雏鸭肝组织病理学变化

2．4 感染P．multocida后雏鸭血清肝功能生化指标的动态变化

2．5 感染P．multocida后雏鸭肝组织中细菌的分布

2．6 感染P．multocida后雏鸭肝损伤中细胞的死亡方式

2．7 P．multocida感染雏鸭致RIPK3／MLKL信号通路激活

2．8 q-PCR检测感染后肝组织中TLR4、TRIF mRNA的表达变化

2．9 IHC检测感染后肝损伤相关指标的变化

2．10 感染P．multocida后肝组织中炎症因子TNF-α、IFN-β、IL-6的变化

讨论

1 感染P．multocida后雏鸭出现禽霍乱的病理学变化

2 细菌在肝组织中的分布及其与肝组织损伤的关系

3 感染P．multocida雏鸭肝组织损伤的方式

4 坏死性凋亡致肝坏死机制分析

4．1 P．multocida致腹腔巨噬细胞出现坏死性凋亡

4．2 P．multocida激活的坏死性凋亡在肝坏死中的作用

结论

参考文献

致谢