猪伪狂犬病病毒荧光抗体的制备及DFA检测方法的建立

摘要

伪狂犬病（Pseudorabies, PR）是由伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus,PRV）引起猪、牛、犬等家畜及野生动物感染的一种急性、热性传染病。猪是 PRV的主要感染动物，感染后表现为共济失调、呼吸困难和繁殖障碍等症状，严重影响了我国养猪业的发展。2011年末，我国9个省/市暴发PR，Bartha-K61疫苗免疫猪群也未能幸免，至今已遍布全国。目前常用的 PRV检测方法为gE/gI-ELISA和 PCR，但是这两种方法对操作要求较高，且耗时长。本文通过荧光标记技术制备 PRV单克隆荧光抗体，并以此建立 PRV直接免疫荧光（Direct immunofluorescence assay, DFA）检测方法，旨在为临床研发一种快速、敏感、准确的PRV诊断方法，为PR的控制和净化奠定基础。
　　本研究主要内容包括：⑴将本实验室保存的PRV gE蛋白2E6株杂交瘤细胞进行复苏、克隆化和活化，注射 BALB/c雌鼠后收集腹水。腹水经辛酸-硫酸铵法纯化，纯化后的单克隆抗体浓度为8.173 mg/mL，抗体效价为1:51200，Western blot结果显示单克隆抗体与PRV gE蛋白有良好的反应原性。单克隆抗体采用低温透析法标记异硫氰酸荧光素（FITC），经葡聚糖凝胶层析柱（Sephadex G-25）纯化，最后制得PRV单克隆荧光抗体。经测定，荧光抗体的 F/P比值为2.578±0.012，具有稳定的荧光信号。⑵通过对固定剂种类、固定时间、工作浓度和孵育时间四个检测条件的摸索后，确定最佳检测条件如下：使用固定剂（60％丙酮+40%乙醇）在-20℃条件下固定20 min，蛋白浓度为13μg/mL的荧光抗体孵育60 min。对建立的检测方法进行特异性、敏感性、重复性和稳定性试验，结果显示单克隆荧光抗体与猪繁殖与呼吸综合症病毒（ PRRSV）、猪瘟病毒（ CSFV）、猪伪狂犬病疫苗毒（ PRV Bartha-K61）、猪细小病毒（PPV）和猪圆环病毒2型（PCV2）均无交叉反应；能检出PRV的最高病毒滴度为1×TCID50；批间批次重复性良好；在-20℃条件下至少保存5个月。⑶采集攻毒死亡猪（二月龄，106.0×TCID50，攻毒4日）的各组织器官，制作冰冻切片后进行DFA检测，并提取组织DNA进行PCR检测。DFA结果显示，淋巴结、扁桃体、肺脏、脾脏、肝脏、肾脏、三叉神经和脊髓等组织呈阳性，大脑、小脑、延髓和脑桥组织呈阴性；而 PCR结果显示除脑桥外其它组织均呈阳性。将DFA和PCR应用于83份临床病料PRV检测，结果显示DFA与PCR的总符合率为74.7%，其中淋巴结和扁桃体的符合率较高，分别为85.7%和93.3%。

目录

声明

缩略语表（Abbreviation）

1文献综述

1.1伪狂犬病概述

1.2免疫荧光技术研究进展

2研究目的与意义

3.1材料

3.2方法

4结果与分析

4.1 PRV gE蛋白2E6株杂交瘤细胞的复苏、克隆化与鉴定

4.2 PRV单克隆抗体的制备与纯化

4.3 FITC标记单克隆荧光抗体的制备与纯化

4.4 PRV DFA检测条件的确定

4.5 PRV DFA检测方法的性能评测

4.6 PRV DFA检测方法的临床初步应用

5讨论

5.1影响固定效果的因素

5.2影响检测结果的因素

5.3 PRV DFA检测方法的性能评估

5.4 PRV DFA检测方法的发展

6结论

参考文献

附录

致谢